甜瓜幼果cDNA文庫的構(gòu)建、酸性轉(zhuǎn)化酶基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文甜瓜幼果cDNA文庫的構(gòu)建、酸性轉(zhuǎn)化酶基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化姓名：于喜艷申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：蔬菜學(xué)指導(dǎo)教師：何啟偉;趙雙宜2003.5.1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文， 撼要| ／甜瓜( C u c u m i s m e a n L ．) 是氆界性的囂要園藝律物。甜瓜營養(yǎng)晶質(zhì)主要取決予果實中可洛性糖的禽曩和種類。因此，在甜瓜果實發(fā)育過程中可溶性糖的積累一直得到了人們懿關(guān)注，豳湊夕} 許多學(xué)老進(jìn)行了這方瑟的研究，褥滋了

2、一致的續(xù)論：熬蕊果實審總耱，尤其是蔗糖含量在距果實憲熟期1 5 天教右開始迅遴提高，而糖的積累是與蔗糖代謝酶的變化息息棚* 的，在果實發(fā)育早期，葡萄糖和果糖禽囂相對較高，而此時酸性轉(zhuǎn)化酶活性也很寒；露露在果實發(fā)旁藤期，蔗糖秘葸糖含量急鼷上秀，俘隱蘩戇是酸毪轉(zhuǎn)他薅活蛙的下降和蔗糖磷酸合成酶活性的提高。由此說明，甜瓜果實中糖的積累和組成憝嚴(yán)格受糖代謝酶的調(diào)控。植物生物技術(shù)j 爭分予生物學(xué)的發(fā)展為研究甜瓜代謝酶基因和殲展甜瓜品質(zhì)育穗囂黲了一條

3、薪途經(jīng)。 f本研究酋先構(gòu)建了甜瓜幼果的e D N A 文庫，并通過R T - P C R 方法克隆到了甜瓜果實酸性轉(zhuǎn)化酶旗醫(yī)c D N A 肚段，構(gòu)建了艇義表達(dá)載體。通過農(nóng)轷菌介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)入煅革和甜瓜，獲褥了轉(zhuǎn)墓囂蘧莩綴探和蘸氟撓蕊愈傷經(jīng)織，獒俸繇究結(jié)鬈鱺下：1 ．甜瓜幼聚e D N A 文庫的構(gòu)建，在2 0 世紀(jì)9 0 年代初，美國的C L O N T E C H 公司發(fā)驥了S M A R T ( S w i t c h i n g M

4、 e c h a n i s m 矗t5 ’’n do fR N AT r a n s c r i p t ) 技術(shù)，使用一個改造了的0 1 i g o ( d T ) 引物，引釋c D N A 第一鏈的合成。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行到m R N A 的5 ’端時，逆轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性農(nóng)c D N A 的3 ’末端加上幾個C ，恰好島滾滾中懿萼l(xiāng) 物S M A R T ⅣO l i g o n u c I e o t i d e 的3 ’螭的尼

5、個G配對，此時及轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)換模板，繼續(xù)復(fù)制S M A R T NO n g o n u c l e o t i d e 的5 ’端，從麗生成了一條含S M A R T I V0 l i g o n u c l e o t i d e 的全長c D N A 。自S M A R T 技術(shù)問世以來，在短暫戇十幾年痰皴梅建了大爨瓣c D N A 文露。象其它的許多分子生甥按本一樣，S M A R T 技術(shù)最初也是應(yīng)糟予動物，當(dāng)他們在動物方灝的研究

6、托較成熟后，才被應(yīng)用到植物中。目前S M A R T 技術(shù)在植物方面的應(yīng)用已有報道，在甜瓜的威用未見報道。本實驗首先把S M A R T技術(shù)應(yīng)用予稚瓜的分子生物學(xué)礤究，成功遮梅建了～令質(zhì)量熹，靛表惶較好的瓣躡幼暴c D N A 文庫。以‘伊利莎白’甜瓜授粉后5 天的果實為材料，采朋一步法提取總R N A ，利用S M A R T技零臺或e D N A 第一鏈，霉經(jīng)2 3 令錘繇靛長距離P C R ( L D - P C R ) 套成雙鏈