甜瓜果實(shí)蔗糖代謝相關(guān)酶基因的克隆、表達(dá)分析及Anti-CmSPS1對(duì)甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、甜瓜(Cucumis melon L.)是世界性的重要園藝作物，糖分組成及含量是衡量甜瓜品質(zhì)的主要依據(jù)之一。蔗糖、葡萄糖和果糖是甜瓜果實(shí)中主要的可溶性糖，其含量和組成對(duì)果實(shí)品質(zhì)起重要作用，它們的含量和組成嚴(yán)格受蔗糖代謝酶調(diào)控，而蔗糖代謝酶包括蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)和轉(zhuǎn)化酶(AI)，其中SPS活性的提高和AI活性的降低是蔗糖積累的首要條件，改變SPS的活性可能會(huì)改變蔗糖的代謝模式。因此，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法改變蔗

2、糖代謝酶的活性對(duì)甜瓜品質(zhì)育種具有重要的意義。 本研究首先通過(guò)RT-PCR及3'、5'RACE技術(shù)克隆到甜瓜果實(shí)蔗糖磷酸合成酶基因和酸性轉(zhuǎn)化酶基因全長(zhǎng)cDNA，研究了這兩個(gè)基因的組織器官表達(dá)特異性和果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特異性，然后構(gòu)建了甜瓜果實(shí)SPS基因的反義表達(dá)載體。以甜瓜自交系M01-3為材料，通過(guò)子房注射法將甜瓜果實(shí)反義蔗糖磷酸合成酶基因進(jìn)行了甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化，得到了轉(zhuǎn)基因植株。研究的主要結(jié)果如下： 1.通過(guò)RT-PC

3、R及3'、5'RACE技術(shù)克隆到甜瓜果實(shí)SPS基因和AI基因全長(zhǎng)cDNA。測(cè)序結(jié)果表明SPS基因全長(zhǎng)為3373 bp，編碼1054個(gè)氨基酸，在GenBank中登記號(hào)為DQ521271，命名為CmSPS1；AI基因全長(zhǎng)為2178 bp，編碼636個(gè)氨基酸，在GenBank中登記號(hào)為EU260044，命名為CmS-AIV1。 2.通過(guò)Northem Blot分析得知，在甜瓜的不同組織中，CmSPS1基因在葉片、莖、果實(shí)中均有表達(dá)，而

4、在根和花中未檢測(cè)到該基因的表達(dá)，而CmS-AIV1基因在花和果實(shí)中表達(dá)，在根、莖、葉中不表達(dá)。在甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，在20 DAP之前沒(méi)有檢測(cè)的CmSPS1基因的表達(dá)，在20 DAP之后，該基因開(kāi)始表達(dá)，到果實(shí)成熟時(shí)表達(dá)量最高；而CmS-AIV1基因的表達(dá)情況與之相反，隨著果實(shí)的成熟表達(dá)量逐漸降低。 3.將克隆在pMD18-T載體上的甜瓜CmSPS1基因用Hinc Ⅱ和Kpn Ⅰ進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳后回

5、收830 bp的片段，將該片段與經(jīng)Kpn Ⅰ和Sma Ⅰ酶切的植物表達(dá)載體pROK2進(jìn)行連接，這樣獲得的重組質(zhì)粒CmSPS1片段反向插入35S啟動(dòng)子之后，TNOS終止子之前。經(jīng)酶切和PCR檢測(cè)表明，我們成功構(gòu)建了甜瓜反義CmSPS1基因的植物表達(dá)載體。 4.本研究利用子房注射法將anti-CmSPS1基因?qū)μ鸸线M(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，應(yīng)用PCR和PCR Southern Blot技術(shù)對(duì)后代進(jìn)行了分子鑒定，在獲得的800株成苗中，共鑒定出