甜瓜果實(shí)醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆和表達(dá)及其對番茄的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、甜瓜(Cucumis melo L.)是世界上重要的園藝作物之一，香氣是衡量其品質(zhì)的重要指標(biāo)，是吸引消費(fèi)者和增強(qiáng)市場競爭力的重要因素之一。甜瓜香氣源于某些揮發(fā)性物質(zhì)，這些揮發(fā)性物質(zhì)主要是酯類、醇類、醛類、萜類和揮發(fā)性酚類等。酯類揮發(fā)性成分作為甜瓜特征香氣成分，多種酶參與了其代謝的調(diào)控，而醇?；D(zhuǎn)移酶(Alcohl Acyltransferaes，AAT)是酯類合成途徑中最末端的關(guān)鍵酶。因此，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法改變醇?；D(zhuǎn)移酶的活性

2、對甜瓜品質(zhì)育種具有重要的意義。 本研究首先通過RT-PCR及3'、5'RACE技術(shù)克隆到甜瓜果實(shí)AAT基因全長cDNA，并做了該基因的時空表達(dá)分析，然后構(gòu)建了甜瓜果實(shí)AAT基因的正反義表達(dá)載體。以番茄自交系Pr1為材料，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將甜瓜果實(shí)反義AAT基因進(jìn)行了番茄的遺傳轉(zhuǎn)化，得到了轉(zhuǎn)基因植株。 研究的主要結(jié)果如下： 1.通過RT-PCR及3'、5'RACE技術(shù)克隆到甜瓜果實(shí)AAT基因。測序結(jié)果表明AAT

3、基因全長為1386 bp，編碼461個氨基酸，在GenBank中登記號為EU431334。 2.通過熒光定量PCR分析得知，在甜瓜果實(shí)的不同發(fā)育時期，甜瓜花后15天之前，表達(dá)量逐漸下降，隨后又逐漸升高，在成熟的果實(shí)中表達(dá)量最高。 3.將克隆在pMD18-T simple(pMD18-T)載體上的甜瓜AAT基因用XbaI和.Sma I(SaII和BamHI)進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳后回收1500 bp(7

4、00bp)的片段，將該片段與經(jīng)XbaI和Sma I(SalI和BamHI)酶切的植物表達(dá)載體pROK3(pBI121)進(jìn)行連接，這樣獲得了AAT基因的正義及反義表達(dá)載體。經(jīng)酶切和PCR檢測表明，我們成功構(gòu)建了甜瓜正反義AAT基因的植物表達(dá)載體。 4.本研究利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的反義載體pBI-MAAT基因?qū)Ψ堰M(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，應(yīng)用PCR技術(shù)對分化植株進(jìn)行了分子鑒定，在獲得的11株成苗中，共鑒定出3株轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率為2