美伐他汀生物合成?；D(zhuǎn)移酶mlcH的克隆、表達(dá)及其定向突變研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著高血脂癥的急劇增加，降血脂藥市場(chǎng)在逐漸升溫。醫(yī)學(xué)界公認(rèn)高膽固醇血癥與動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病之間存在明顯的相關(guān)性，血清總膽固醇特別是低密度脂蛋白膽固醇水平的升高，對(duì)于疾病的發(fā)生、發(fā)展起著尤其重要的作用。他汀類藥物是膽固醇合成途徑關(guān)鍵調(diào)控酶HMG-CoA(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A)還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能夠有效地降低內(nèi)源性膽固醇的合成，同時(shí)又代償性增加臟器細(xì)胞內(nèi)低密度脂

2、蛋白受體(LDLR)的合成，提高對(duì)血液中低密度脂蛋白(LDL)的攝取，降低血液中總膽固醇的含量，最終達(dá)到降低血脂的目的。他汀類藥物與傳統(tǒng)降脂藥物相比，其降低血清膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇效果顯著、副作用少、安全性高，成為降血脂藥物中的首要選擇。美伐他汀是最早發(fā)現(xiàn)的他汀類化合物，隨后通過(guò)對(duì)其結(jié)構(gòu)類似物的尋找，發(fā)現(xiàn)了全球第一個(gè)通過(guò)FDA批準(zhǔn)上市的HMG-CoA還原酶抑制劑——洛伐他汀，美伐他汀目前主要作為工業(yè)上生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)普法他汀的直接前體

3、。
　　 美伐他汀生物合成基因簇及假想的生物合成途徑的研究表明美伐他汀是一類典型的聚酮類化合物，其合成是在聚酮合成酶(PKS)的參與下完成的，對(duì)于關(guān)鍵調(diào)控酶功能活性的研究為更好的開發(fā)美伐他汀提供了新的思路和依據(jù)。美伐他汀生物合成基因簇全長(zhǎng)38kb，其中mlcH基因長(zhǎng)約1257bp，編碼推測(cè)的?；D(zhuǎn)移酶，分子量大小約為46kD。研究表明，lovD基因編碼的?；D(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)將?；鶞y(cè)鏈連接到莫那可林J的C8位形成洛伐他汀，這種?；D(zhuǎn)移酶

4、對(duì)于底物?；鶞y(cè)鏈、萘環(huán)具有廣泛的寬容性，利用這種寬容性成功一步轉(zhuǎn)化莫那可林J生成辛伐他汀。輝伐他汀是一種報(bào)道的具有更優(yōu)降脂活性的他汀化合物，體外驗(yàn)證mlcH基因編碼的?；D(zhuǎn)移酶活性，在全細(xì)胞的條件下，利用其底物寬容性一步轉(zhuǎn)化6-羥基-6-去甲基莫那可林J生成輝伐他汀具有一定的應(yīng)用前景。
　　 本文利用RT-PCR技術(shù)成功地克隆了美伐他汀產(chǎn)生菌橘青霉(Penicillium citrinum)中美伐他汀生物合成基因簇中的mlcH基

5、因，通過(guò)測(cè)序及序列比對(duì)證實(shí)，序列全憐1257bp,編碼418個(gè)氨基酸，與(Penicillium citrinum)mlcH的蛋白序列(登錄號(hào)：AB072893)相比只有一個(gè)氨基酸的差異，即1064位一個(gè)堿基的突變導(dǎo)致谷氨酸被甘氨酸所取代。將目的基因片段構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28a(+)上，以E.coli BL21(DE3)為宿主添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白以包涵體形式存在，利用8M尿素對(duì)其進(jìn)行變性，采用Ni2+-NTA agaros

6、e親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，然后利用添加了L-精氨酸、甘油、Triton-X100等組份的透析原液成功透析復(fù)性目的蛋白，在添加了4 mM美伐他汀、10μM MlcH的HEPES反應(yīng)體系中，HPLC檢測(cè)出新峰的出現(xiàn)，從而證實(shí)了MlcH的美伐他汀水解活性，研究不同pH(6.5-9)對(duì)酶催化水解反應(yīng)的影響，表明酶的最適pH為8.0，在最適pH值條件下研究不同溫度對(duì)于酶反應(yīng)的影響，表明酶反應(yīng)的最適溫度為45℃。向Swiss-Model Re

7、pository提交橘青霉MlcH的氨基酸序列，服務(wù)器自動(dòng)搜索與之匹配的最佳模板為Burkholderia gladioli的酯酶EstB，利用pymol軟件對(duì)MlcH蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析，推測(cè)空間表面的Cys65對(duì)于分子交聯(lián)起一定作用，運(yùn)用大引物PCR方法成功進(jìn)行MlcH蛋白C65A的定點(diǎn)突變，突變后蛋白的溶解性實(shí)驗(yàn)表明，包涵體蛋白的含量明顯減少。
　　 隨著他汀類藥物研究的不斷深入，利用分子生物學(xué)方法來(lái)研究他汀生物合成