茯苓甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶基因克隆與功能驗(yàn)證.pdf

1、茯苓為我國(guó)的傳統(tǒng)用藥，有幾千年的歷史，具有利水滲濕、健脾、寧心之功效，同時(shí)在食物方面也有很廣的用途，比如茯苓糕，茯苓酒等。茯苓酸是茯苓的主要活性成分之一，其有抗腫瘤，抗炎抗氧化，降血糖，鎮(zhèn)靜催眠等許多功效。而目前市場(chǎng)上的茯苓酸主要是從茯苓中直接提取，由于茯苓栽培條件的限制，茯苓酸的提取量也會(huì)受到一定影響，未來(lái)用工程菌株來(lái)發(fā)酵茯苓酸是一種解決的辦法，但是目前關(guān)于茯苓酸在茯苓體內(nèi)是如何合成的，還沒(méi)有弄清楚。在本研究中，首先推測(cè)了茯苓酸在茯苓

2、體內(nèi)的生物合成途徑，并進(jìn)行了關(guān)鍵酶的預(yù)測(cè)，對(duì)甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了克隆與功能驗(yàn)證。主要的研究結(jié)果如下:
　　1、預(yù)測(cè)茯苓酸的生物合成途徑涉及四個(gè)關(guān)鍵酶基因，分別是細(xì)胞色素P450s;甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶(SMT1);甾醇?；D(zhuǎn)移酶(SOAT);固醇酯水解酶(TGL4)。由羊毛甾醇經(jīng)過(guò)一系列的催化反應(yīng)合成茯苓酸。
　　2、對(duì)SMT1基因進(jìn)行了基因克隆，得到了兩條含有完整閱讀框的基因，分別是SMT1-1和SMT1-2。其

3、中SMT1-1的開(kāi)放閱讀框有1038個(gè)堿基，與基因組序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，含有2個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)外顯子，編碼345個(gè)氨基酸，是穩(wěn)定的親水性蛋白。同時(shí)，SMT1-2基因的開(kāi)放閱讀框有1050個(gè)堿基，有4個(gè)內(nèi)含子，5個(gè)外顯子，編碼349個(gè)氨基酸，也是穩(wěn)定的親水性蛋白。蛋白3D結(jié)構(gòu)模擬發(fā)現(xiàn)蛋白SMT1-1與SMT1-2結(jié)構(gòu)高度相似，系統(tǒng)發(fā)育分析表明SMT1的蛋白與物種Xanthophyllomycesdendrorhous中的SMT1系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系很近。

4、
　　3、構(gòu)建原核表達(dá)載體pCold-SMT1，并且轉(zhuǎn)化到E.coli表達(dá)菌株BL21(Pg-KJE8)里面。成功優(yōu)化獲得了好的原核表達(dá)條件。用獲取的SMT1蛋白驗(yàn)證了3β-羥基羊毛甾-8，24-二烯-21-酸(trametenolic acid)生成齒孔酸(eburicoic acid)的反應(yīng)。
　　4、利用熒光定量PCR討論了SMT1基因在茯苓體表達(dá)情況。在PDA培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)茯苓菌絲。在6、9、12、15、18天