羧甲基轉(zhuǎn)移酶StnF3及碳甲基轉(zhuǎn)移酶MarI的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、甲基轉(zhuǎn)移酶是一類重要的修飾酶，主要以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）作為甲基供體，催化底物的碳、氮、氧或硫原子的甲基化反應(yīng)。鏈黑菌素是由一株絨毛鏈霉菌產(chǎn)生的多官能團(tuán)的生物堿類抗生素，具有多種生物活性，如廣譜的抗菌活性、抗病毒活性，以及強(qiáng)烈的、廣譜的抗腫瘤活性。前期的研究表明，鏈黑菌素的生物合成基因簇中含有8個編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的基因，其中包括一個碳-甲基轉(zhuǎn)移酶StnQ1,三個氧甲基轉(zhuǎn)移酶（StnQ2-Q

2、4）和四個亮氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶(StnF1-F4)。這四個羧甲基轉(zhuǎn)移酶具有高度的一致性（61-68％）和相似性（72-77%），其中StnF2專一性地催化淡紫醌霉素的甲基化生成淡紫醌霉素甲酯，StnF3則催化10?-去甲基鏈黑菌素和10?-去甲氧基鏈黑菌素的甲基化生成相應(yīng)的甲酯，而其他的羧甲基轉(zhuǎn)移酶則不能催化相應(yīng)的反應(yīng)，表明盡管這四個羧甲基轉(zhuǎn)移酶高度同源，但是具有較嚴(yán)格的底物專一性。為了闡明羧甲基轉(zhuǎn)移酶的底物選擇性機(jī)理，我們開展了它們的結(jié)

3、構(gòu)生物學(xué)研究，期望獲得它們的晶體結(jié)構(gòu)。
　　我們成功地獲得了StnF3的單晶，通過Se-SAD的方法解析了StnF3的母體晶體結(jié)構(gòu)，同時也獲得了StnF3-SAM和StnF3-SAH復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，明確了StnF3的SAM結(jié)合位點。通過分子動力學(xué)模擬，提出了StnF3結(jié)合SAM的活性口袋的開-關(guān)狀態(tài)。在StnF3母體的結(jié)構(gòu)中該口袋處于關(guān)閉（close）狀態(tài)，而在溶液中，活性口袋周圍的較為靈活的loop區(qū)域發(fā)生移動使活性口袋轉(zhuǎn)為開

4、（open）的狀態(tài)，從而為結(jié)合SAM提供空間。此外，利用StnF3-SAM復(fù)合物結(jié)構(gòu)與底物進(jìn)行分子對接，提出了ARG-16和TYR-177與底物的結(jié)合有關(guān)，并利用點突變進(jìn)行的證實，R16A和Y177F的活性相較于母體分別降低了約240倍和70倍。由此表明，該區(qū)域與底物的結(jié)合的確密切相關(guān)。通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，與SAM和底物結(jié)合相關(guān)的loop區(qū)域正是StnF3與其他三個羧甲基轉(zhuǎn)移酶差異最大之處，可以初步解釋其他羧甲基轉(zhuǎn)移酶不能替代StnF3

5、的原因。
　　StnQ1及其同源蛋白MarI(Maremycin的生物合成途徑)被證實不僅可以催化吲哚丙酮酸的?-碳甲基化反應(yīng)，而且在較高濃度下可以直接催化色氨酸的?-碳甲基化。該反應(yīng)是從未報道過的，表明StnQ1和MarI可能通過一個全新的機(jī)理催化色氨酸的甲基化反應(yīng)。于是，我們開展了StnQ1和MarI的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。我們只獲得了MarI的單晶，但是分辨率不足以解析它的結(jié)構(gòu)。我們進(jìn)一步獲得了MarI與SAM的復(fù)合物的晶體，經(jīng)X