組蛋白甲基轉移酶SMYD3調控神經母細胞瘤增殖的研究.pdf

1、神經母細胞瘤(neuroblastoma，NB)來源于交感神經系統(tǒng)，是一種常見的小兒顱外實體外周神經系統(tǒng)惡性腫瘤，占兒童腫瘤發(fā)生率的8％～10%以及兒童癌癥死亡的15%。神經母細胞瘤從良性神經元到形成腫瘤的過程都具有異質性，其較強的增殖和轉移能力是導致患者死亡的主要因素。其中，60%患兒初步診斷時年齡大于1歲，45%患兒在發(fā)現(xiàn)時已經有遠處轉移。神經母細胞瘤的臨床表現(xiàn)各不相同，在晚期的病人中通常會發(fā)現(xiàn)其對包括手術、化療和放療等傳統(tǒng)的治療方

2、法具有很強的抗性。因此，近年來大量的實驗致力于探索針對神經母細胞瘤的新的治療手段。
　　SMYD3（SET and MYND domain-containingprotein3）是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白甲基轉移酶。研究表明,SMYD3在肝癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌等癌癥組織或細胞中高表達，而在相應正常組織中低表達甚至檢測不到，這說明 SMYD3與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有緊密的聯(lián)系。本研究通過探究SMYD3對神經母細胞瘤細胞的增殖和成瘤作

3、用，以期能為神經母細胞瘤的治療提供新的思路。
　　本文首次揭示SMYD3對神經母細胞瘤的增殖和凋亡過程的重要作用，基于腫瘤臨床預后數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn)，SMYD3可以顯著影響神經母細胞瘤患者的預后狀況，同時檢測了SMYD3在不同神經母細胞瘤細胞系中的表達水平。通過在神經母細胞瘤細胞系BE(2)-C和SHEP1中進行SMYD3敲低和恢復表達實驗，檢測其對細胞的生長增殖以及周期和凋亡的影響，探索其對細胞增殖的調控作用。實驗的主要的結果如下

4、：
　　1.組蛋白甲基化轉移酶SMYD3對神經母細胞瘤患者的預后影響及其表達分析
　　通過分析神經母細胞瘤的預后數(shù)據(jù)庫Versteeg，發(fā)現(xiàn)SMYD3高水平表達的患者的生存率明顯低于低表達的患者，且SMYD3的表達水平與腫瘤患者的腫瘤等級、患病年齡等顯著相關，這表明SMYD3可能與神經母細胞瘤的惡性程度有一定關系。通過熒光定量PCR和Western blot實驗檢測SMYD3在神經母細胞瘤細胞系中的表達水平，結果表明SMYD

5、3在神經母細胞瘤中普遍表達，并且與腫瘤的惡性程度相關。
　　2.SMYD3促進神經母細胞瘤生長
　　為了探究SMYD3促進神經母細胞瘤惡性增殖的機理，我們用慢病毒包裝SMYD3的干涉和過表達載體后感染人神經母細胞瘤細胞系，用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定細胞系，從而檢測SMYD3表達水平改變對神經母細胞瘤生長的影響。細胞增殖曲線和BrdU標記實驗顯示，干涉SMYD3明顯抑制了細胞的體外增殖能力。通過流式細胞術分析細胞周期分布發(fā)現(xiàn)，SM

6、YD3干涉的BE(2)C和SHEP1細胞的S期比例明顯減少，而過表達SMYD3細胞的S期比例增加。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，干涉SMYD3表達后，G1/S期周期蛋白CDK2和cyclinE的表達明顯受到抑制。通過建立小鼠皮下成瘤動物模型，發(fā)現(xiàn)干涉SMYD3后細胞的成瘤能力降低，而過表達恢復后細胞的成瘤能力得到了一定程度的提升。軟瓊脂克隆形成實驗得出，SMYD3干涉的BE(2)C和SHEP1細胞形成的克隆不僅數(shù)量減少，而且體積縮小

7、。這些結果表明，SMYD3能夠促進神經母細胞瘤的生長，所以針對SMYD3的靶向治療有望起到干擾神經母細胞瘤進一步發(fā)展的作用。
　　3.SMYD3通過抑制P53/P21途徑來促進神經母細胞瘤生長
　　通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，在胃癌細胞中SMYD3可能通過抑制p53的蛋白水平來促進細胞的增殖，故采用Western blot檢測SMYD3干涉對p53和p21的蛋白水平影響，并進行SMYD3表達恢復實驗。在BE(2)C和SHEP1細胞系中

8、干涉SMYD3表達引起p53和p21水平升高，而在SMYD3干涉的細胞感染過表達SMYD3的慢病毒時，SMYD3含量有一定程度的恢復，原先升高的p53/p21水平有所降低。Real-time RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，當干涉SMYD3表達時，p53的經典泛素化蛋白MDM2未變化，而泛素化蛋白酶TRIM24表達水平下調；恢復表達SMYD3后，TRIM24表達隨之上調，而MDM2未變化。這些結果說明，SMYD3對p53