組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD3調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖的研究.pdf

1、神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)來源于交感神經(jīng)系統(tǒng)，是一種常見的小兒顱外實體外周神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，占兒童腫瘤發(fā)生率的8％～10%以及兒童癌癥死亡的15%。神經(jīng)母細(xì)胞瘤從良性神經(jīng)元到形成腫瘤的過程都具有異質(zhì)性，其較強(qiáng)的增殖和轉(zhuǎn)移能力是導(dǎo)致患者死亡的主要因素。其中，60%患兒初步診斷時年齡大于1歲，45%患兒在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床表現(xiàn)各不相同，在晚期的病人中通常會發(fā)現(xiàn)其對包括手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)的治療方

2、法具有很強(qiáng)的抗性。因此，近年來大量的實驗致力于探索針對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的新的治療手段。
　　SMYD3（SET and MYND domain-containingprotein3）是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。研究表明,SMYD3在肝癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等癌癥組織或細(xì)胞中高表達(dá)，而在相應(yīng)正常組織中低表達(dá)甚至檢測不到，這說明 SMYD3與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有緊密的聯(lián)系。本研究通過探究SMYD3對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和成瘤作

3、用，以期能為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供新的思路。
　　本文首次揭示SMYD3對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖和凋亡過程的重要作用，基于腫瘤臨床預(yù)后數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn)，SMYD3可以顯著影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后狀況，同時檢測了SMYD3在不同神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平。通過在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系BE(2)-C和SHEP1中進(jìn)行SMYD3敲低和恢復(fù)表達(dá)實驗，檢測其對細(xì)胞的生長增殖以及周期和凋亡的影響，探索其對細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。實驗的主要的結(jié)果如下

4、：
　　1.組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SMYD3對神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后影響及其表達(dá)分析
　　通過分析神經(jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后數(shù)據(jù)庫Versteeg，發(fā)現(xiàn)SMYD3高水平表達(dá)的患者的生存率明顯低于低表達(dá)的患者，且SMYD3的表達(dá)水平與腫瘤患者的腫瘤等級、患病年齡等顯著相關(guān)，這表明SMYD3可能與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的惡性程度有一定關(guān)系。通過熒光定量PCR和Western blot實驗檢測SMYD3在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平，結(jié)果表明SMYD

5、3在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中普遍表達(dá)，并且與腫瘤的惡性程度相關(guān)。
　　2.SMYD3促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長
　　為了探究SMYD3促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性增殖的機(jī)理，我們用慢病毒包裝SMYD3的干涉和過表達(dá)載體后感染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞系，從而檢測SMYD3表達(dá)水平改變對神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長的影響。細(xì)胞增殖曲線和BrdU標(biāo)記實驗顯示，干涉SMYD3明顯抑制了細(xì)胞的體外增殖能力。通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)，SM

6、YD3干涉的BE(2)C和SHEP1細(xì)胞的S期比例明顯減少，而過表達(dá)SMYD3細(xì)胞的S期比例增加。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，干涉SMYD3表達(dá)后，G1/S期周期蛋白CDK2和cyclinE的表達(dá)明顯受到抑制。通過建立小鼠皮下成瘤動物模型，發(fā)現(xiàn)干涉SMYD3后細(xì)胞的成瘤能力降低，而過表達(dá)恢復(fù)后細(xì)胞的成瘤能力得到了一定程度的提升。軟瓊脂克隆形成實驗得出，SMYD3干涉的BE(2)C和SHEP1細(xì)胞形成的克隆不僅數(shù)量減少，而且體積縮小

7、。這些結(jié)果表明，SMYD3能夠促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長，所以針對SMYD3的靶向治療有望起到干擾神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)一步發(fā)展的作用。
　　3.SMYD3通過抑制P53/P21途徑來促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長
　　通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中SMYD3可能通過抑制p53的蛋白水平來促進(jìn)細(xì)胞的增殖，故采用Western blot檢測SMYD3干涉對p53和p21的蛋白水平影響，并進(jìn)行SMYD3表達(dá)恢復(fù)實驗。在BE(2)C和SHEP1細(xì)胞系中

8、干涉SMYD3表達(dá)引起p53和p21水平升高，而在SMYD3干涉的細(xì)胞感染過表達(dá)SMYD3的慢病毒時，SMYD3含量有一定程度的恢復(fù)，原先升高的p53/p21水平有所降低。Real-time RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)干涉SMYD3表達(dá)時，p53的經(jīng)典泛素化蛋白MDM2未變化，而泛素化蛋白酶TRIM24表達(dá)水平下調(diào)；恢復(fù)表達(dá)SMYD3后，TRIM24表達(dá)隨之上調(diào)，而MDM2未變化。這些結(jié)果說明，SMYD3對p53