甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長與增殖的調(diào)控研究.pdf

1、昆蟲干細(xì)胞生物學(xué)是昆蟲學(xué)研究領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)難點(diǎn)之一，但截至目前除果蠅外，昆蟲干細(xì)胞的研究開展尚不充分。家蠶作為鱗翅目昆蟲的典型代表，其一生經(jīng)歷多次新舊組織的交替和結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化，開展家蠶干細(xì)胞研究，特別是研究家蠶發(fā)育、變態(tài)過程中干細(xì)胞調(diào)控的作用機(jī)制，將為闡明昆蟲發(fā)育的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為鱗翅目害蟲的防治新策略提供理論依據(jù)。相對于果蠅及哺乳動物較為完善的干細(xì)胞研究系統(tǒng)，家蠶干細(xì)胞研究技術(shù)體系的建立迫在眉睫。針對目前缺少家蠶干細(xì)胞特異性分

2、子標(biāo)記這一關(guān)鍵技術(shù)難題，選取起源于胚胎發(fā)育時期具有分化潛力的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞作為替代研究對象，尋找調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖與分化的關(guān)鍵酶基因，闡明靶點(diǎn)基因?qū)ζ浼?xì)胞增殖與分化的作用機(jī)理，探索該腫瘤的發(fā)生機(jī)理，借鑒其研究結(jié)果，將為開展家蠶干細(xì)胞的鑒定、維持及分化的調(diào)控研究提供理論參考。
　　神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種兒童最常見的顱外實(shí)體腫瘤，主要起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)嵴祖細(xì)胞，其臨床表現(xiàn)具有高異質(zhì)性、惡性程度高、預(yù)后差、易轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)等特

3、點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞生長的表觀遺傳調(diào)控是當(dāng)前腫瘤生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，諸多實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)組蛋白甲基化對腫瘤的生長增殖有著十分重要的影響。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶通過參與組蛋白甲基化，對腫瘤的生長發(fā)育起著重要的作用，研究組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶的功能及作用機(jī)制，有重要的理論及臨床價值?；诮M蛋白甲基化的調(diào)控紊亂可能在多種人類疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，本研究以組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a及5種神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞作為研究對象，利用神經(jīng)母細(xì)胞瘤在線臨床數(shù)據(jù)庫中患者基因組

4、表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，探討G9a與神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系。利用G9asi質(zhì)粒通過慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并同時使用G9a特異性抑制劑處理細(xì)胞，檢測G9a受到抑制時對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長與增殖的影響，探討G9a在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中對組蛋白甲基化的形式的影響及其對細(xì)胞生長增殖調(diào)控作用的分子機(jī)制，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床治療新策略提供理論依據(jù)及新思路，為家蠶干細(xì)胞的維持及分化調(diào)控提供理論支持。
　　本研究獲得的主要研究

5、結(jié)果如下:
　　1.組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a與神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)后的關(guān)系分析
　　利用兩個獨(dú)立的神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床在線數(shù)據(jù)庫，檢索組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a在神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者基因組表達(dá)譜巾的表達(dá)情況，分析并預(yù)測G9a的表達(dá)量與神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果表明，G9a的表達(dá)量與神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后結(jié)果密切相關(guān)，G9a表達(dá)量高，患者整體存活率低，預(yù)后差;G9a表達(dá)量低，患者整體存活率高，預(yù)后好。并且，G9a在不同臨床分期的神經(jīng)母細(xì)

6、胞瘤患者體內(nèi)表達(dá)情況有差異，其中在Ⅳ期患者中G9a的表達(dá)量突然顯著升高，而在Ⅳ-s期患者中其表達(dá)量又明顯下降。在患兒診斷年齡≤18個月時，G9a的表達(dá)量低，在患兒診斷年齡＞18個月時，G9a的表達(dá)量高。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療效果與診斷時患兒的年齡及臨床分期有關(guān)，患兒年齡越大，分期越后，腫瘤越容易擴(kuò)散，則預(yù)后越差，而患兒診斷年齡18個月被定義為決定風(fēng)險的關(guān)鍵年齡節(jié)點(diǎn)?；谏窠?jīng)母細(xì)胞瘤的這些特點(diǎn)，我們推測G9a可能成為神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者風(fēng)險分層中

7、的重要參考指標(biāo)，并作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)后的一個重要標(biāo)記。同時我們發(fā)現(xiàn)G9a的表達(dá)量與神經(jīng)母細(xì)胞瘤原癌基因N-MYC的擴(kuò)增密切相關(guān)，由于神經(jīng)母細(xì)胞瘤起源于胚胎發(fā)育過程中的神經(jīng)嵴細(xì)胞，并且N-MYC的擴(kuò)增與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生及復(fù)發(fā)緊密聯(lián)系，推測G9a可能參與調(diào)控原癌基因或抑癌基因在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)機(jī)制，使交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控系統(tǒng)發(fā)生紊亂，促使神經(jīng)母細(xì)胞瘤的形成。
　　2.抑制組蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長增

8、殖的影響及機(jī)制研究
　　為了鑒定G9a基因?qū)ι窠?jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長增殖的影響及其分子機(jī)制，本研究利用G9a特異性抑制劑BIX01294(BIX)處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞引起G9a抑制，并通過慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)利用G9asi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞干涉其G9a的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測和細(xì)胞周期檢測。研究結(jié)果表明，G9a受BIX抑制或G9asi干涉后，神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長受到抑制，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。利用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯

9、示G9a受BIX抑制或受G9asi干涉后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖基本上被完全抑制。同時利用BrdU、Ki67等增殖標(biāo)記的抗體對處于增殖周期的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G9a受BIX抑制或受G9asi干涉后BrdU陽性率及Ki67陽性率都顯著降低，證實(shí)細(xì)胞增殖受到明顯抑制。進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果表明G9a受BIX抑制后G1期顯著增加，S期減少，說明細(xì)胞周期阻滯在G1期。通過Western blotting檢測C

10、yclin和CDK的表達(dá)顯示，G9a受BIX抑制或受G9asi干涉后，多個G1期特異性Cyclin和CDK的蛋白水平明顯降低，推測G9a可能調(diào)控G1期特異性Cyclin和CDK的表達(dá)，促使細(xì)胞周期阻滯在G1期，不能順利進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖。
　　3.抑制組蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a引起神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬及其機(jī)制研究
　　本研究發(fā)現(xiàn)G9a受到抑制后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長增殖受到抑制作用，為了探討G9a受到抑制引起神經(jīng)

11、母細(xì)胞瘤生長增殖受到抑制的作用機(jī)制，本研究利用G9a特異性抑制劑BIX處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞引起G9a抑制，并通過慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)利用G9asi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞干涉其G9a的表達(dá)，利用臺酚藍(lán)對BIX處理后的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，G9a受抑制后死亡細(xì)胞的數(shù)量增加，并且通過顯微鏡觀察細(xì)胞核周圍出現(xiàn)點(diǎn)狀物質(zhì)的聚集并產(chǎn)生空泡結(jié)構(gòu)，推測G9a受到抑制導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬從而抑制細(xì)胞生長增殖。微管相關(guān)蛋白LC3B能夠標(biāo)記自噬體的形成，本研究

12、進(jìn)一步利用LC3B抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示G9a受BIX抑制或受G9asi干涉都促使LC3B大量表達(dá)，證實(shí)細(xì)胞自噬的發(fā)生。通過Western blotting檢測多個自噬相關(guān)基因ATG的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示G9a受BIX抑制或受G9asi干涉促進(jìn)ATG表達(dá)升高及LC3B表達(dá)增強(qiáng)，同時通過Westernblotting檢測到BIX處理后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞G9a蛋白表達(dá)沒有明顯降低，但H3K9me2水平顯著下降，說明抑制劑BIX不影

13、響G9a的表達(dá)，但顯著抑制G9a的功能，并且G9asi干涉后H3K9me2也顯著降低，推測G9a功能失活導(dǎo)致H3K9me2的水平受到抑制，促使LC3B和ATGs的轉(zhuǎn)錄增加，從而促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。
　　4.抑制組蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自我更新能力及致瘤性的影響研究
　　神經(jīng)母細(xì)胞瘤作為一種兒童常見的交感神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，因?yàn)槠涓弋愘|(zhì)性，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，因此其治療十分困難。惡性腫瘤易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)是

14、因?yàn)樵谀[瘤細(xì)胞中存在一小群細(xì)胞，稱為腫瘤干細(xì)胞，其能夠引發(fā)腫瘤的發(fā)生發(fā)展并維持腫瘤的特性，并且其具有無限復(fù)制和自我更新能力。為了進(jìn)一步闡明G9a對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長發(fā)育的影響，本研究利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及神經(jīng)母細(xì)胞瘤小鼠模型的建立，檢測抑制G9a對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自我更新能力及致瘤性的影響。將神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞稀釋成單細(xì)胞種入軟瓊脂進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BIX處理后的細(xì)胞或G9asi干涉后的細(xì)胞幾乎不能在軟瓊脂上形成克隆，而對照組細(xì)胞能夠形成