miRNA-558對神經(jīng)母細胞瘤中肝素酶表達的調(diào)控作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述:
　　第一部分:神經(jīng)母細胞瘤組織和細胞中miR-558上調(diào)與HPSE表達水平呈正相關
　　目的：探討miR-558、HPSE在神經(jīng)母細胞瘤組織和細胞株中的表達水平及二者的關聯(lián)性。
　　方法：通過miRNA–promoter interaction database和 AGO–chromosome interaction profiling data(GSE40536)軟件預測AGO蛋白富

2、集的HPSE啟動子區(qū)域所能結合的miRNAs；雙熒光素酶實驗驗證預測到的miRNAs對HPSE啟動子活性的影響；通過R2數(shù)據(jù)庫檢索miR-558宿主基因BIRC6(baculoviral IAP repeat containing6)在神經(jīng)母細胞瘤中的表達水平；實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測30例NB標本、正常脊髓背根神經(jīng)節(jié)和培養(yǎng)的SK-N-SH、SK-N-AS、SH-SY5Y和SK-N-BE(2)細胞系中成熟miR-5

3、58水平；Western blot assay進一步驗證HPSE的表達水平及其與miR-558的關系。
　　結果：AGO1富集于HPSE轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)上游?2468/?2591 bp區(qū)域，該區(qū)域存在miR-145、miR-558和miR-17的結合位點，分別位于HPSE TSS上游2330/2345、2314/2332和2292/2313bp的位置；雙熒光素酶實驗表明轉(zhuǎn)染miR-558 inhibitor和mimic能導致

4、HPSE啟動子活性分別降低、增高，而miR-145或 miR-17對啟動子活性沒有影響；R2數(shù)據(jù)庫分析表明：與正常背根神經(jīng)節(jié)相比，BIRC6的表達在88例NB組織中是上調(diào)的(P<0.0001)。此外，BIRC6的水平與 International Neuroblastoma Staging System(INSS)分期(P=0.007)、神經(jīng)母細胞瘤的侵襲性(P=0.0079)相關聯(lián)；qRT-PCR檢測表明：與正常背根神經(jīng)節(jié)比較，成熟m

5、iR-558在神經(jīng)母細胞瘤組織和細胞中表達上調(diào)；Western blot檢測表明HPSE在NB組織和細胞系中高表達。在NB組織和細胞系中，miR-558的表達與HPSE的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(R=0.633, P<0.0001)。在低分化(P=0.0001)的 NB組織中，觀察到更高的 miR-558表達或更高的 HPSE蛋白水平(P=0.0011)。
　　結論：在NB組織和細胞系中，神經(jīng)母細胞瘤分化程度越低，miR-558和HPSE

6、表達量越多，miRNA可以調(diào)節(jié)HPSE的轉(zhuǎn)錄，且miR-558上調(diào)與 HPSE的表達水平呈正相關。
　　第二部分:miR-558促進HPSE表達的機制研究
　　目的：研究miR-558是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平促進 HPSE的表達。
　　方法：分別進行了miRNA-558敲低和過表達實驗：anti-miR-558 inhibitor轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細胞瘤細胞后，qRT-PCR及Western blot檢測HPSE、VEGF新

7、生轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平；過表達miR-558后，RT-PCR及Western blot檢測HPSE、VEGF在NB細胞中的表達情況；通過 miRNA–啟動子相互作用數(shù)據(jù)庫檢索在 HPSE的3′-UTR有無miR-558的結合位點。
　　結果：敲低miRNA-558導致SH-SY5Y和SK-N-BE(2)細胞中HPSE、VEGF新生轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平下降；miR-558穩(wěn)定表達細胞系檢測的結果是相反的。在神經(jīng)母細胞瘤細胞系，敲低或過表達m

8、iR-558對VEGF3’-UTR和HPSE3'-UTR的雙熒光素酶活性無影響，表明miR-558不參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
　　結論：在神經(jīng)母細胞瘤中，miR-558通過轉(zhuǎn)錄激活進而促進HPSE的表達，并通過HPSE調(diào)節(jié)VEGF的表達，miR-558不參與HPSE的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
　　第三部分:miR-558通過靶向HPSE促進神經(jīng)母細胞瘤細胞體外生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成活性
　　目的：通過敲低和過表達 miRNA-558，

9、研究其對培養(yǎng)的神經(jīng)母細胞瘤細胞生物學功能（生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成）的影響，通過回補HPSE進一步研究對生物學功能的改變。
　　方法：通過轉(zhuǎn)染miR-558質(zhì)粒，建立穩(wěn)定表達miRNA-558的SH-SY5Y、SK-N-SH細胞系。MTT比色法和軟瓊脂實驗檢測敲低或過表達miR-558對腫瘤細胞生存與生長能力的影響；劃痕遷移實驗檢測敲低或過表達miR-558對NB細胞遷移能力的影響；Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染敲低或過表達mi

10、R-558后，NB細胞侵襲能力的改變；轉(zhuǎn)染了敲低miR-558或過表達miR-558的NB細胞上清被用來進行血管形成實驗；分別過表達和敲低HPSE回補HPSE的水平，進行回補實驗， Western blot檢測HPSE和VEGF的表達水平。
　　結果：Western blot結果顯示轉(zhuǎn)染HPSE可以回補miR-558敲低所引起的HPSE和VEGF的下調(diào)。MTT比色法和軟瓊脂實驗表明：anti-miR-558 inhibitor轉(zhuǎn)染

11、的腫瘤細胞生存與生長能力降低；在劃痕遷移實驗中，anti-miR-558 inhibitor抑制SH-SY5Y和 SK-N-BE(2)細胞的遷移能力；Transwell實驗表明：轉(zhuǎn)染了anti-miR-558 inhibitor的NB細胞相對于轉(zhuǎn)染anti-NC的細胞而言，侵襲能力減弱；用 anti-miR-558 inhibitor轉(zhuǎn)染的NB細胞的上清預處理基質(zhì)膠后，內(nèi)皮細胞血管形成受抑制；另一方面，miR-558過表達的作用是相反的

12、；而且，通過轉(zhuǎn)染HPSE或HPSE siRNA恢復HPSE的表達可以回補這些生物學功能的改變。同時，恢復VEGF的水平只能部分抑制NB細胞中轉(zhuǎn)染miR-558所引起的生長、遷移、侵襲和血管生成等生物學特征的改變。
　　結論：miR-558通過靶向HPSE顯著促進NB細胞的體外生長、遷移，侵襲和血管生成。
　　第四部分:敲低miR-558抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移和血管生成
　　目的：研究敲低miRNA-558對

13、腫瘤體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移和血管形成的影響。
　　方法：經(jīng)尾靜脈注射anti-miR-558 inhibitor觀察對SH-SY5Y細胞建立的皮下種植瘤裸鼠模型的影響，記錄瘤體的體積及重量；裸鼠體表瘤體行免疫組織化學染色檢測CD31-陽性微血管和平均血管密度；鼠尾轉(zhuǎn)移模型的肺組織行HE染色檢測轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目。
　　結果：與anti-NC處理組相比，anti-miR-558 inhibitor組裸鼠皮下種植瘤的腫瘤體積和重量都是下降的；