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文檔簡介
1、背景與目的:
N-myc擴(kuò)增與神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma,NB)惡性表型和快速進(jìn)展密切相關(guān),然而促發(fā)N-myc擴(kuò)增的機(jī)制尚未闡明。文獻(xiàn)報(bào)道,微小RNA-221(microRNA-221,miR-221)在N-myc擴(kuò)增的NB中表達(dá)上調(diào)。本課題以miR-221為切入點(diǎn),結(jié)合臨床病例,分析miR-221在NB中的表達(dá),及與N-myc表達(dá)和患者臨床病例特征的相關(guān)性,通過NB細(xì)胞的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),探討miR-221對NB細(xì)胞
2、增殖的影響及對N-myc表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
方法:
1.miR-221在NB中的表達(dá)及其與N-myc表達(dá)和臨床病例特征相關(guān)性分析:收集31例NB患兒病例資料及石蠟切片,鎖核酸原位雜交(Locked nucleic acid-in situ hybridization,LNA-ISH)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)檢測NB組織中miR-221表達(dá),免疫組化檢測
3、NB組織中N-myc表達(dá),分析miR-221與N-myc表達(dá)和NB臨床病例特征的相關(guān)性;qRT-PCR和Western blot檢測四種NB細(xì)胞系(SH-SY5Y、SK-N-SH、SK-N-DZ和IMR-32)中miR-221、N-myc表達(dá)。
2.miR-221對NB增殖的影響:構(gòu)建miR-221過表達(dá)慢病毒載體并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)和對照載體的細(xì)胞株(分別命名為miR-221-up和control細(xì)胞),qRT-PCR檢測m
4、iR-221的表達(dá)水平,CCK8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化;將SH-SY5Y,control及miR-221-up細(xì)胞分別接種至裸鼠背部皮下,建立裸鼠移植瘤模型,動(dòng)態(tài)觀察移植瘤的生長,測量瘤體重量和體積,Ki67染色檢測移植瘤細(xì)胞增殖能力。
3.miR-221促進(jìn)N-myc擴(kuò)增的分子機(jī)制:qRT-PCR和Western blot檢測SH-SY5Y,control及miR-221-up細(xì)胞和移植
5、瘤中NLK,LEF1,p-LEF1,N-myc mRNA和蛋白的表達(dá),免疫熒光檢測細(xì)胞中 NLK,p-LEF1,N-myc蛋白的表達(dá),免疫組化檢測移植瘤中NLK,p-LEF1,N-myc蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:
1.qRT-PCR和LNA-ISH結(jié)合免疫組化結(jié)果顯示miR-221在N-myc高表達(dá)的NB組織中表達(dá)顯著增多(p<0.05);臨床病例統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)miR-221表達(dá)與NB患兒生存時(shí)間成負(fù)相關(guān),miR-221高表
6、達(dá)者生存時(shí)間短(p=0.0425);但miR-221表達(dá)水平與NB患兒年齡、性別、腫瘤大小、分化、轉(zhuǎn)移與腫瘤分期無關(guān)(p>0.05);qRT-PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),與SH-SY5Y細(xì)胞相比,SK-N-DZ和IMR-32細(xì)胞中miR-221表達(dá),N-myc的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增高(p<0.05),而SK-N-SH細(xì)胞無顯著變化(p>0.05)。
2.成功構(gòu)建miR-221過表達(dá)慢病毒載體;與SH-SY5
7、Y細(xì)胞相比,miR-221-up細(xì)胞中miR-221表達(dá)升高約7倍(p<0.05);CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-221-up細(xì)胞的增殖能力較SH-SY5Y細(xì)胞明顯增強(qiáng)(p<0.05);流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)miR-221-up細(xì)胞較SH-SY5Y細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少(p<0.05),S期細(xì)胞比例顯著增多(p<0.05);與 SH-SY5Y細(xì)胞注射組相比,miR-221-up細(xì)胞注射組裸鼠移植瘤的體積和重量顯著增加(p<
8、0.05);Ki67結(jié)果表明 miR-221-up細(xì)胞注射組Ki67陽性細(xì)胞較SH-SY5Y細(xì)胞注射組明顯增多(p<0.05)。
3.與SH-SY5Y細(xì)胞相比,qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-221-up細(xì)胞中N-myc的mRNA明顯增加(p<0.05),而NLK和LEF1無顯著變化(p>0.05),Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示,miR-221-up細(xì)胞中NLK和p-LEF1蛋白表達(dá)均明顯減少(p<0.05),N-
9、myc蛋白表達(dá)明顯增加(p<0.05),而 LEF1蛋白表達(dá)無明顯變化(p>0.05);與 SH-SY5Y細(xì)胞注射組相比,qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-221-up細(xì)胞注射組中N-myc的mRNA明顯增加(p<0.05),而NLK和LEF1無顯著變化(p>0.05), Western blot和免疫組化發(fā)現(xiàn)miR-221-up細(xì)胞注射組移植瘤中NLK和p-LEF1蛋白表達(dá)均明顯降低(p<0.05),N-myc蛋白表達(dá)明顯增多(p<0.0
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