miR-221下調RAD51并提高化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用.pdf

1、DNA雙鏈斷裂（Double strand breaks，DSBs）是一種非常嚴重的DNA損傷。DSBs如果不能修復則可能導致染色體的斷裂以及細胞死亡，若修復不當可能致使染色體發(fā)生缺失、易位和倒位等重排，從而易于導致腫瘤等相關疾病。生物體存在多種DNA修復系統(tǒng)以保證基因組的完整性。DSBs的主要修復方式有同源重組修復（Homologous recombination repair，HRR）和非同源末端連接(Non-homologous

2、end joining，NHEJ)修復，其中同源重組修復是S期DSBs修復最主要的方式。當DNA發(fā)生了雙鏈斷裂(DSBs)，基因組內序列相同的DNA即可被當作模板來修復斷裂。真核細胞中的RAD51蛋白是DNA同源重組修復中的關鍵性蛋白質。RAD51在人類多種腫瘤細胞中高表達，而RAD51的高表達可能致使腫瘤產生耐藥性。因此如何有效的下調細胞內RAD51的水平從而使提高腫瘤的治療效果是目前需要解決的問題。
　　MicroRNA(mi

3、RNA)是近年來在多種真核細胞以及病毒中發(fā)現(xiàn)的微小的非編碼單鏈RNA。microRNA基于與靶基因mRNA的序列部分或全部互補對靶基因進行轉錄后的表達調控。microRNA被發(fā)現(xiàn)作用于DNA損傷修復網絡的許多環(huán)節(jié)，因此尋找能夠參與調控DNA修復的miRNA以及其調控靶點非常重要。
　　我們通過軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-221可能作用于RAD51mRNA。我們通過高表達或抑制miR-221驗證了miR-221對RAD51的負調控，發(fā)現(xiàn)mi

4、R-221可降低DNA同源重組修復的效率以及基因組穩(wěn)定性。miR-221造成腫瘤細胞在藥物處理下的生存率降低。
　　[研究目的]
　　本課題研究了人類骨肉瘤細胞(U2OS)中，miR-221對RAD51的調控作用，并研究其在細胞增殖、DNA雙鏈斷裂修復以及細胞對化療藥物敏感性等方面的作用。
　　[研究方法]
　　生物信息學軟件預測可能作用于RAD51的microRNA，篩選出候選miR-221。
　　利用慢

5、病毒轉染將miR-221導入人類成骨肉瘤(U2OS)細胞，建立穩(wěn)定表達miR-221的細胞系，利用Western blotting檢測miR-221對細胞中RAD51蛋白水平的影響。
　　構建含RAD51 mRNA 3'UTR的熒光素酶報告系統(tǒng)，研究miR-221對RAD51的負調控。
　　通過免疫熒光方法檢測DNA雙鏈損傷標記γ-H2AX及同源重組修復過程中的關鍵步驟RAD51焦點形成。
　　通過計數(shù)微核發(fā)生評估基因

6、組不穩(wěn)定性。
　　利用MTT法檢測藥物處理后細胞生存率。
　　[實驗結果]
　　1.Western blotting結果表明轉染miR-221的成骨肉瘤U2OS細胞中RAD51蛋白水平明顯下調。
　　2.X射線照射后，miR-221轉染細胞中RAD51焦點數(shù)目少于對照（miR-neg），表明同源重組修復過程受阻。
　　3.使用電離輻射處理細胞，發(fā)現(xiàn)miR-221細胞組γ-H2AX陽性細胞比例數(shù)高于miR-n

7、eg細胞組，表明轉染miR-221后DNA雙鏈斷裂的修復受阻。同時miR-221組γ-H2AX陽性微核頻率也高于miR-neg組，表明miR-221導致基因組不穩(wěn)定性升高。
　　4.含RAD51 3'UTR的熒光素酶報告基因顯示，轉染miR-221之后熒光素酶表達量下降，表明miR-221可負調控RAD51。
　　5.轉染miR-221抑制劑到U2OS細胞中，檢測RAD51蛋白表達，結果顯示在miR-221表達受到抑制時RA