反義抑制miR-221和miR-222對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及SIRT1在此過程中作用.pdf

1、第一部分反義抑制miR-221和miR-222對(duì)前列腺癌細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)功能的影響
　　目的：
　　檢測抑制miR-221和miR-222對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　方法：
　　(1)分別轉(zhuǎn)染miR-221 inhibitor質(zhì)粒和miR-222 inhibitor質(zhì)粒，通過G418篩選構(gòu)建PC-3細(xì)胞miR-221低表達(dá)細(xì)胞株和miR-222低表達(dá)細(xì)胞株。通過Realtime PCR對(duì)構(gòu)建的mi

2、R-221低表達(dá)細(xì)胞株和miR-222低表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行驗(yàn)證。
　　(2)應(yīng)用CCK-8方法檢測miR-221 inhibitor和miR-222 inhibitor對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響。
　　(3)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-221 inhibitor和miR-222 inhibitor對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　(4)細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)以及transwell小室檢測miR-221 inhibitor和miR-222inh

3、ibitor對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　(1) Real time PCR顯示，轉(zhuǎn)染miR-221 inhibitor質(zhì)粒和miR-222 inhibitor質(zhì)粒后，細(xì)胞中miR-221或者miR-222表達(dá)下調(diào)。
　　(2)成功抑制miR-221和miR-222表達(dá)后，與空載pEX-5組比較，細(xì)胞的增殖能力(OD值/450nm)明顯下調(diào)。
　　(3)成功抑制m iR-221和miR-222表達(dá)后，各

4、組(pEX-5，miR-221 inhibitor，miR-222 inhibitor)相對(duì)于對(duì)照組的凋亡率分別是（1.03±0.02），(2.84±0.65)，（2.63±0.44），miR-221和miR-222低表達(dá)組的相對(duì)凋亡率相對(duì)于pEX-5對(duì)照組，顯著升高并且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(4)轉(zhuǎn)染pEX-5，miR-221 inhibitor，miR-222 inhibitor后，利用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察各組的

5、閉合速率，結(jié)果顯示，與對(duì)照組pEX-5比較，miR-221 inhibitor組與miR-222 inhibitor組的遷移速率在48小時(shí)和72小時(shí)明顯降低。結(jié)果見圖表。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　抑制細(xì)胞中miR-221和miR-222表達(dá)后，可以抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 SIRT1對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　目的

6、：
　　觀察SIRT1對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)作用的影響。
　　方法：
　　(1)轉(zhuǎn)染SIRT1抑制質(zhì)粒后，通過G418篩選構(gòu)建SIRT1低表達(dá)細(xì)胞株。
　　(2)應(yīng)用CCK-8方法檢測SIRT1對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響。
　　(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測SIRT1對(duì)凋亡的影響。
　　(4)transwell小室檢測SIRT1對(duì)細(xì)胞遷移本領(lǐng)的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)成功構(gòu)建SIRT1低表達(dá)細(xì)胞株

7、。
　　(2)成功抑制PC-3細(xì)胞中SIRT1表達(dá)后，細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組之間沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(3)成功抑制SIRT1表達(dá)后，pGPU6組與pGPU6-siSIRT1組相對(duì)于pGPU6的凋亡率分別是（1.06±0.04）和（0.62±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　(4)成功抑制SIRT1表達(dá)后，利用transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測pGPU6組和siSIRT組穿過小室膜的相

8、對(duì)細(xì)胞數(shù)分別是（1.02±0.02）和（2.33±0.20），兩組穿過細(xì)胞數(shù)的相對(duì)量之間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　抑制細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)后，雖然對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖沒有產(chǎn)生明顯的影響，但抑制了細(xì)胞的凋亡并且促進(jìn)了細(xì)胞遷移。
　　第三部分 miR-221和miR-222對(duì)SIRT1的調(diào)節(jié)作用
　　目的：
　　驗(yàn)證反義抑制miR-221和miR-222是否通過調(diào)節(jié)SIRT1的表

9、達(dá)而影響前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能。
　　方法：
　　(1)抑制細(xì)胞中miR-221和miR-222后，免疫印記方法和熒光定量PCR檢測SIRT1在蛋白水平和mRNA水平的變化。
　　(2)雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR-221和miR-222是否與SIRT1存在靶向結(jié)合關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　(1)分別抑制miR-221和miR-222后，各組SIRT1在蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量分別是（1.00±0.01）、（

10、2.0±0.17）、（1.7±0.05），抑制miR-221和miR-221后，SIRT1蛋白表達(dá)增高(P＜0.05，P＜0.01 v.s.pEX-5);但在mRNA水平的表達(dá)分別是（0.99±0.05）、（1.2±0.1）、（1.1±0.05），各組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(2)雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，抑制miR-221和miR-222組的螢光素酶活性與對(duì)照組螢光素酶活性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：