敲低miR-221和miR-222表達對膠質(zhì)瘤的抑制作用及機制的研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的46%。惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為5-8/100，000，世界衛(wèi)生組織1998年公布按死亡率順序排位，惡性膠質(zhì)瘤是34歲以下腫瘤患者的第2位死亡原因，是35～54歲患者的第4位死亡原因。由于膠質(zhì)瘤的侵襲性生長，手術(shù)難以完全切除；化療和放療既不能高度特異性地殺傷膠質(zhì)瘤細胞，治療效果差，又可能產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒、副作用。上述情況在近30年的臨床實踐中未得到根本改善，因此腦膠質(zhì)瘤仍是神經(jīng)外科領(lǐng)域的難

2、治性疾病，闡明發(fā)病機理、尋找新的治療手段的仍然是神經(jīng)外科的熱點課題。 目前分子病理學(xué)認為膠質(zhì)瘤本質(zhì)上是一種多基因異常疾病，通過一種/多種癌基因的過表達、同時伴隨抑癌基因的突變?nèi)笔亩剐盘杺鲗?dǎo)通路異常，腫瘤細胞逃避了正常生長調(diào)控機制，自主進行增殖和侵襲、出現(xiàn)惡性表型。近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA或miRNA）為長度約21～25核苷酸的小型非編碼RNA，這些miRNA通過與靶mRNA的3'非編碼區(qū)結(jié)合，可在轉(zhuǎn)錄后水

3、平通過促進靶mRNA降解和/或抑制其翻譯而發(fā)揮負調(diào)控基因表達的作用。已有研究證明超過50%的miRs定位在癌相關(guān)基因區(qū)域或在脆弱區(qū)域，尤其是發(fā)現(xiàn)有些miRs在腫瘤細胞與相應(yīng)正常細胞中的表達截然不同，這使人們有理由相信miRs與腫瘤生成有關(guān)。同樣，在研究膠質(zhì)瘤miRs表達譜時發(fā)現(xiàn)一些miRs表達與正常星形細胞不同，其中miR-221和miR-222的表達明顯高于正常星形細胞。miR-221和miR-222是通過調(diào)控哪些靶基因的表達來促進膠

4、質(zhì)瘤的生成，敲低膠質(zhì)瘤miR-221和miR-222表達是否可以逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤的惡性表型，從而成為膠質(zhì)瘤新的治療靶點，這些都是值得關(guān)注的重要課題。為此，本研究將著重探索miR221和miR222在膠質(zhì)瘤惡性表型中所起的作用，通過體內(nèi)外研究來證實敲低膠質(zhì)瘤miR-221和miR-222表達對膠質(zhì)瘤生長的抑制作用。通過鑒定miR221和miR222的靶基因來探討敲低膠質(zhì)瘤miR-221和miR-222表達對膠質(zhì)瘤抑制作用的機制。通過聯(lián)合放射治療

5、來探討敲低膠質(zhì)瘤miR-221和miR-222與放療是否具有抑制膠質(zhì)瘤生長的協(xié)同作用。 本研究分為五個部分進行： 1．分析膠質(zhì)瘤中miRNA表達數(shù)據(jù)，并通過人工合成2'-O-methyl（OMe）修飾的反義寡核苷酸（As-miR-221和As-miR-222）敲低膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251細胞中miR-221和miR-222的表達來系統(tǒng)分析miR-221和miR-222對膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生、進展所起的作用。 2用脂

6、質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染As-miR-221/222于膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251，敲低miR-221和miR-222表達，觀察膠質(zhì)瘤細胞增殖活性、細胞周期、侵襲能力及細胞凋亡等生物學(xué)性狀的變化。 3通過生物信息學(xué)的方法獲得miR-221和miR-222的潛在靶基因，并通過熒光素酶報告載體策略進行鑒定，初步探討敲低膠質(zhì)瘤miR-221和miR-222表達抑制膠質(zhì)瘤生長的作用機制。 4構(gòu)建U251裸鼠皮下荷瘤模型，進行反義miRNA22

7、1/222的體內(nèi)治療，觀察腫瘤生長速度與體積，將腫瘤組織進行免疫組化染色和原位雜交分析，進一步驗證反義miRNA221/222治療后腫瘤靶基因的表達變化以及與細胞增殖，細胞周期，侵襲及凋亡的關(guān)系。 5通過平板克隆形成實驗證實敲低膠質(zhì)瘤細胞系U251細胞的miR-221和miR-222表達對放射治療是否具有增敏效果。 通過本實驗，可以得出以下幾個結(jié)論： 1．膠質(zhì)瘤中存在一系列miRNA表達異常，miR-221和mi

8、R-222是其中表達上調(diào)的成簇miRs，miR-221過表達可以被認為是人腦膠質(zhì)瘤新的分子標(biāo)簽。 2．p27kip1、PUMA、PTEN、TIMP3、Cx43基因mRNA的3’UTR是miR-221和miR-222直接作用靶點。 3．Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染2’-O-methyl（OMe）修飾的反義寡核苷酸-As-miR-221/222可有效敲低miR-221和miR-222在U251人膠質(zhì)母細胞瘤細胞

9、系的表達，同時上調(diào)靶基因的表達，從而其惡性表型得以逆轉(zhuǎn)，包括細胞的增殖和侵襲能力受到抑制，出現(xiàn)G0/G1期阻滯，并誘導(dǎo)細胞凋亡。 4．裸鼠皮下膠質(zhì)瘤模型應(yīng)用Lipofectamine2000介導(dǎo)的As-miR-221/222治療，同樣可有效敲低miR-221和miR-222的表達，增加靶基因的表達（p27kip1、PUMA、PTEN、TIMP3、Cx43），從而抑制腫瘤的生長，誘導(dǎo)細胞凋亡，與體外試驗結(jié)果一致。 5．敲低