過(guò)表達(dá)miR-101調(diào)節(jié)腦膠質(zhì)瘤增殖、遷移的機(jī)制研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤為顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的46％左右，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）可分為I-IV級(jí)，其中IV級(jí)中預(yù)后最差的病理分型的是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM）?；颊咦匀徊〕潭嘣诎肽暌詢?nèi)。且經(jīng)過(guò)手術(shù)、放化療以及免疫靶向治療，患者中位生存期沒(méi)有明顯延長(zhǎng)。
　　MicroRNA（miRNA）分子作為一種可以通過(guò)靶向作用于多個(gè)靶基因而又同時(shí)被多個(gè)基因作為共同的靶標(biāo)的分子，普遍存在于動(dòng)植

2、物體內(nèi)的內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，其在生命活動(dòng)中起到了多種作用。MiRNA通過(guò)特異的互補(bǔ)識(shí)別位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄后一直靶基因的翻譯，或者降解調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)水平。膠質(zhì)瘤作為最致命的顱內(nèi)惡性腫瘤之一，其中也存在microRNA表達(dá)譜異常。以往研究表明多種microRNA亞型與已知的膠質(zhì)瘤主要的相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)，即microRNA的異常表達(dá)參與了膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和侵襲。同時(shí)，外源性的把microRNA分子人為導(dǎo)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞，可以有效糾正相關(guān)micro

3、RNA亞型表達(dá)下調(diào)的相關(guān)表型，為利用microRNA進(jìn)行外源性導(dǎo)入治療腦膠質(zhì)提供了重要依據(jù)。
　　MiR-101在以往文獻(xiàn)的研究中表明：miR-101低表達(dá)與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)關(guān)系，并且低表達(dá)miR-101的肝癌患者的生存率較低。有報(bào)道表明，miR-101能夠直接抑制EZH2和c-Myc的表達(dá)，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖于侵襲。在臨床患者，膠質(zhì)瘤的術(shù)后差和復(fù)發(fā)率高于腫瘤其本身的高侵襲性有關(guān)，miR-101在以往的研究中參與影

4、響膠質(zhì)瘤的侵襲和和增殖性，但具體的下游作用分子到目前還沒(méi)有完全弄清楚，所以在膠質(zhì)瘤中研究miR-101與其腫瘤的高侵襲性的關(guān)系的具體機(jī)制變得十分重要。
　　本研究中，我們通過(guò)文獻(xiàn)回顧和相關(guān)軟件的生物信息學(xué)分析，我們將研究放在miR-101與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系上。首先，為研究miR-101與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲的關(guān)系，我們通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)臨床腫瘤和正常腦組織標(biāo)本中miR-101的表達(dá)水平；同時(shí)利用過(guò)表達(dá)m

5、iR-101的慢病毒感染U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-101的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)分析了miR-101對(duì)于膠質(zhì)瘤的體內(nèi)、外的影響；其次，為明確miR-101抑制膠質(zhì)瘤增殖、遷移的分子機(jī)制，運(yùn)用分子克隆技術(shù)檢測(cè)結(jié)合文獻(xiàn)和靶基因預(yù)測(cè)軟件分析的靶基因的3’UTR區(qū)域，并將其連接到pGL3-Control的報(bào)告載體上。同時(shí)利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、Western blot及

6、qRT-PCR等多種方法證實(shí)SOX9在膠質(zhì)瘤中是miR-101調(diào)控的直接靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)應(yīng)用慢病毒技術(shù)構(gòu)建了干涉轉(zhuǎn)錄因子SOX9表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。應(yīng)用通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等分析SOX9對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞表型影響；
　　通過(guò)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，qRT-PCR分析結(jié)果證明膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的miR-101的表達(dá)水平較正常腦組織明顯降低；慢病毒感染U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞后miR-101的表達(dá)水平明顯升高；MTT實(shí)驗(yàn)顯

7、示過(guò)表達(dá)miR-101促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移的能力；裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)證明過(guò)表達(dá)miR-101可以有效抑制裸鼠皮下成瘤的能力；熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、Western blot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明SOX9確實(shí)為miR-101的下游調(diào)控的直接靶基因；利用慢病毒技術(shù)構(gòu)建干涉轉(zhuǎn)錄因子SOX9的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，Western blot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明了干涉SOX9可以有效降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。
　　綜上所述，我們認(rèn)為在膠質(zhì)瘤中存