RNF126在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、在真核核細(xì)胞內(nèi)主要啟動(dòng)兩條途徑來(lái)誘導(dǎo)蛋白的降解:其一，溶酶體途徑，內(nèi)化膜蛋白及被吞入胞內(nèi)的外來(lái)蛋白的降解主要經(jīng)此途徑;其二，非溶酶體途徑，此途徑主要指導(dǎo)將一些被泛素結(jié)合修飾后的胞內(nèi)蛋白進(jìn)行降解。泛素為76個(gè)氨基酸所構(gòu)建的蛋白，典型的蛋白泛素化過(guò)程需要先后經(jīng)過(guò)泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3的作用進(jìn)行順序催化反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)E3決定了催化底物的特異性。在直接能源物質(zhì)ATP參與下，泛素-蛋白酶體經(jīng)泛素的修飾和引導(dǎo)，先后通過(guò)E1、

2、E2、E3多步驟復(fù)雜的酶促反應(yīng)，最終使底物蛋白質(zhì)的特異性氨基酸殘基被泛素所標(biāo)記，從而完成了目標(biāo)底物蛋白的泛素化。
　　研究表明，大量的蛋白轉(zhuǎn)錄后的修飾過(guò)程均是通過(guò)泛素來(lái)進(jìn)行的。泛素發(fā)揮作用機(jī)制主要是經(jīng)三步酶促反應(yīng)后使其與靶向蛋白上的特定氨基酸殘基以共價(jià)鍵相聯(lián)接。具體來(lái)講，泛素激活酶E1使泛素活化，之后傳遞給泛素結(jié)合酶E2，最后通過(guò)泛素連接酶E3的連接作用實(shí)現(xiàn)泛素同底物蛋白的賴(lài)氨酸殘基結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了底物蛋白的整體泛素化過(guò)程。其中，

3、E2決定泛素修飾反應(yīng)類(lèi)型，而E3具有底物特異性。基因工程科學(xué)的進(jìn)展使泛素化精細(xì)機(jī)制進(jìn)一步展現(xiàn)，被確定的E1酶有2種，E2酶50余種而E3酶的種類(lèi)已經(jīng)多達(dá)600余種。E3酶系家族成員可被分為RING-finger家族及HECT(homologous to E6AP C terminus)家族，RING-finger家族的成員最多，其分子結(jié)構(gòu)中所含的E2結(jié)合結(jié)構(gòu)域均極其相似，也均發(fā)揮將活化泛素轉(zhuǎn)移、連接至靶蛋白氨基酸殘基的橋梁作用，該家族E

4、3自身不直接同泛素起作用。HECT家族成員E3具有HECT催化結(jié)構(gòu)域，這使的該類(lèi)E3不僅直接同E2相結(jié)合，更會(huì)通過(guò)其分子結(jié)構(gòu)中保守Cys殘基同活化后的泛素經(jīng)硫酯鍵相聯(lián)接，整體上看，E2將泛素活化后傳遞給E3，最后由E3將之呈遞給底物蛋白，使底物蛋白實(shí)現(xiàn)泛素化。隨著基因科學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的泛素連接酶被不斷發(fā)現(xiàn)，泛素化機(jī)制及其重要的生物學(xué)作用愈加引起相關(guān)學(xué)者的高度重視。
　　泛素水解蛋白系統(tǒng)是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解的一個(gè)

5、重要途徑，由于降解異常導(dǎo)致癌蛋白的積累往往會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，泛素連接酶被人們認(rèn)為是分子靶向治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。截至目前，已經(jīng)有多個(gè)針對(duì)泛素連接酶抑制劑被報(bào)道具有較好的抗腫瘤作用，如Mdm2(Mouse double minute2)和NEDD8-Activating Enzyme(NAE)的抑制劑等。
　　RNF126是環(huán)指泛素連接酶家族的一員，在其N(xiāo)末端包含一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，在C末端包含一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)域。已有研究表明RN

6、F126可能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，比如乳腺癌。我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RNF126在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織表達(dá)存在較大差異，提示RNF126可能是調(diào)控膠質(zhì)瘤發(fā)生的一個(gè)潛在蛋白。因此，RNF126在膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)作用和機(jī)制值得進(jìn)一步研究。
　　第一部分 RNF126與p27在膠質(zhì)瘤中的蛋白表達(dá)以及相關(guān)性研究
　　目的:觀察RNF126與p27于人正常腦組織及不同惡性級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)情況，探究此兩種基因之間的表達(dá)相關(guān)性。<

7、br>　　方法:該部分的研究分成正常腦組織組、Ⅲ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組和Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組共三個(gè)研究組，其中，正常腦組織標(biāo)本均取自嚴(yán)重顱腦損傷后接受顱內(nèi)減壓手術(shù)患者的正常腦組織。采用Western Blot法檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤及正常腦組織內(nèi)RNF126與p27的蛋白水平，其中膠質(zhì)瘤和正常腦組織各7例，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;并分析兩種基因表達(dá)的相關(guān)性。另外，應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)了RNF26在不同惡性程度的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果

8、:1.我們通過(guò)免疫印跡法分析了RNF26和p27在非瘤腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):非瘤腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中均有RNF126蛋白的表達(dá)，而與非瘤腦組織相比，腦膠質(zhì)瘤中RNF126蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而p27的表達(dá)則與RNF26呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=-0.71。2.我們分析了RNF126在不同惡性程度的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示RNF26在不同惡性程度的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在差

9、異，惡性程度越高，RNF26的表達(dá)越高。
　　結(jié)論:1、RNF126和p27在非瘤腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中均有表達(dá)。RNF126在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)較非瘤組織中表達(dá)明顯增加，且與細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子p27呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。2、RNF26在惡性程度越高的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系表達(dá)越高。
　　第二部分 RNF126對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用及其分子機(jī)制研究
　　目的:觀察RNF126對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響，探索其中存在的分子作用機(jī)制，為膠質(zhì)瘤

10、分子靶向治療尋找潛在新作用靶點(diǎn)。
　　方法:1.分子克隆技術(shù)構(gòu)建LV-shRNF126和LV-GFP-RNF126質(zhì)粒，并包裝慢病毒侵染膠質(zhì)瘤細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定沉默和過(guò)表達(dá)RNF126的細(xì)胞系。2.在構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系中，進(jìn)行EdU滲入實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默和過(guò)表達(dá)RNF126的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力。3.運(yùn)用免疫共沉淀技術(shù)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNF126和p27的相互作用，以及p27的蛋白水平和泛素化水平的變化。
　

11、　結(jié)果:(1)通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNF126沉默效率，免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染pLV-shRNF126＃1組細(xì)胞中RNF126沉默效果達(dá)80％以上。隨后應(yīng)用LV-shRNF126和LV-GFP-RNF126質(zhì)粒包裝慢病毒侵染膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，免疫熒光觀察示侵染效率在90％以上且沉默效果良好，提示U251-shRNF126沉默細(xì)胞系構(gòu)建成功。(2)為了驗(yàn)證RNF126對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的重要性，我們用U251-shRNF126及U251-

12、control細(xì)胞系進(jìn)行了EdU實(shí)驗(yàn)，EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:U251-shRNF126增殖率較U251-control增殖率低57％。同時(shí)，利用U251-shRNF126及U251-control細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:U251-shRNF126細(xì)胞較U251-control克隆形成能力明顯降低。另外，我們用U251-shRNF126及U251-control細(xì)胞系進(jìn)行了MTT實(shí)驗(yàn)，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果同EdU及集落形成實(shí)驗(yàn)

13、研究結(jié)果一致，顯示沉默RNF126后細(xì)胞增殖能力明顯減弱。以上結(jié)果表明沉默RNF126后細(xì)胞增殖能力減弱，那么過(guò)表達(dá)RNF126后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力有何變化？為了進(jìn)一步探討RNF126對(duì)細(xì)胞增殖的影響，我們包裝了GFP-RNF126和GFP慢病毒，并用慢病毒侵染U251細(xì)胞，構(gòu)建U251-GFP-RNF126和U251-GFP細(xì)胞系。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示侵染效率在90％以上。為了檢測(cè)U251-GFP-RNF126細(xì)胞系中外源性RNF126

14、表達(dá)情況，我們提取U251-GFP-RNF126和U251-GFP細(xì)胞蛋白，通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)示RNF126在U251細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)，說(shuō)明U251-GFP-RNF126和U251-GFP細(xì)胞系構(gòu)建成功。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RNF126促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用，我們通過(guò)對(duì)U251-GFP-RNF126及U251-GFP細(xì)胞系中進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)。EdU檢測(cè)結(jié)果顯示U251-GFP-RNF126細(xì)胞增殖率較U251-GFP細(xì)胞增高

15、110％。通過(guò)對(duì)U251-GFP-RNF126及U251-GFP細(xì)胞系檢測(cè)細(xì)胞集落形成能力，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:U251-GFP-RNF126細(xì)胞較U251-GFP細(xì)胞克隆形成能力明顯提高。MTT實(shí)驗(yàn)也顯示U251-GFP-RNF126及U251-GFP較對(duì)照組增殖能力明顯增強(qiáng)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RNF126可能在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中起著重要作用，沉默RNF126明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，過(guò)表達(dá)RNF126則明顯促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。(3)為進(jìn)一

16、步探討RNF126究竟是通過(guò)何種分子機(jī)制來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，我們首先在U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FLAG-RNF126后，通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證了p27與RNF126的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在U251細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RNF126可以與p27相互結(jié)合。進(jìn)一步內(nèi)源蛋白Co-IP證明細(xì)胞內(nèi)源的RNF26同樣可以與p27相互作用。(4)然后我們又發(fā)現(xiàn)，沉默RNF126明顯上調(diào)p27的蛋白水平，而過(guò)表達(dá)RNF26則明顯下調(diào)p27的蛋白水平。相應(yīng)地，沉默RN

17、F126明顯減弱p27的泛素化，而過(guò)表達(dá)RNF26則明顯增加p27的泛素化。最后我們證明RNF126介導(dǎo)的p27降解可以被蛋白酶體抑制劑MG132阻斷。我們也試圖做了體外泛素化實(shí)驗(yàn)，然而我們沒(méi)有檢測(cè)到p27的體外泛素化反應(yīng)。這說(shuō)明可能有其他一些因素參與到RNF126介導(dǎo)的p27泛素化過(guò)程中，比如p27的修飾，或者其他一些接頭蛋白等?？傊?，我們的研究闡明了RNF26在膠質(zhì)瘤增殖中高表達(dá)，并且可以通過(guò)負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期抑制子p27促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞