Axin在全反式維甲酸抗膠質瘤細胞增殖及促凋亡作用中的機制研究.pdf

1、研究背景：維甲酸類化合物(retinoids)是一類維生素A衍生物，包括維甲酸（retinoicacidRA）、維胺酸（retinamide）、維胺酯（retimidester）和天然維生素A（retinol）等。維生酸A對生命活動必不可少，它對胚胎發(fā)育、精子發(fā)生、視覺和細胞分化都有十分重要的作用。早期研究表明維生素A缺乏的動物易發(fā)生腫瘤。在飲食中加入藥理學濃度的維生素能減少化學藥物誘發(fā)腫瘤的發(fā)生率。維甲酸類化合物最引人注目的作用是預防

2、及治療一些惡性腫瘤，包括白血病、乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌、中樞神經系統(tǒng)腫瘤等。給予RA或合成維甲酸類似物導致人的多種腫瘤細胞株或腫瘤異種移植物生長停止、凋亡和分化。全反式維甲酸屬于第三代維甲酸，該維甲酸類化合物由于多烯肽側鏈的改變及羧基方向不同分為兩種異構體，即順式維甲酸（cis-retinoicacidcisRA）及全反式維甲酸(all-transretinoicacidATRA)，其中全反式構型最為穩(wěn)定和常見。RA及其衍生物主要通過其

3、經典的核受體信號通路（RARs和RXRs）從三個方面發(fā)揮抗腫瘤作用：誘導腫瘤細胞分化，生長抑制和誘導腫瘤細胞的凋亡。大量的研究表明，RA介導的核受體信號轉導通路與Wnt/beta-canetin等信號轉導通路之間存在著的相互作用（talkcross），共同調控細胞的分化、增殖及凋亡。
　　Axin（Axisinhibition）是1997年發(fā)現(xiàn)的小鼠Fused基因的編碼產物，它是Wnt信號通路的重要的構架蛋白，它將進入細胞的信號整

4、合并傳給下游的效應分子，從而實現(xiàn)相應的生物學功能。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)Axin至少通過Wnt、、JNK、TGF-β及p53等信號通路中發(fā)揮重要作用。其生物學功能涉及胚胎發(fā)育、糖原代謝、腫瘤形成、細胞分化、細胞凋亡等方面。特別是近年來，Axin作為腫瘤抑制因子，引起人們廣泛的興趣。Axin過表達的轉基因小鼠中出現(xiàn)不同組織器官大量細胞死亡，腺病毒轉染野生型Axin基因到腫瘤細胞，可導致腫瘤細胞凋亡。我們實驗室以往研究證實野生型小鼠Axin基因

5、的過表達可抑制膠質瘤細胞C6的增殖并誘導其凋亡。近期研究表明Axin參與全反式維甲酸（all-transretinoicacidATRA）促胚胎癌細胞株分化的調節(jié)，提示Axin可能是維甲酸類化合物調控細胞增殖、分化、凋亡的一個重要的調節(jié)分子。
　　膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的腫瘤（約占原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)腫瘤的42％），其中四分之三是惡性腫瘤。大量的臨床及實驗研究表明RA可以有效地降低膠質瘤的復發(fā)率，提高患者的生存率。明確Axin在

6、ATRA調控膠質瘤的增殖、凋亡中的作用，將有助于我們進一步探討膠質瘤的發(fā)病機理并為其生物學治療提供依據(jù)。
　　目的：探討Axin基因是否參與ATRA介導的膠質瘤細胞株的增殖、凋亡及其作用機制。
　　方法：（1）治療量的ATRA處理膠質瘤C6、U251細胞株，采用MTT比色法繪制細胞生長曲線、平板克隆形成實驗對細胞克隆形成能力進行了檢測、BrdUrd摻入實驗檢測細胞的增殖能力、流式細胞儀測定細胞增殖、凋亡狀態(tài)的變化。（2）應用

7、免疫熒光檢測β-catenin在細胞內的定位、RT-PCR及Westernblot方法分別檢測Axin、p53、β-catenin的mRNA及其蛋白質的表達的變化。（3）膠質瘤C6細胞用脂質體轉染法瞬時轉染rAxin，流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡的變化；采用免疫熒光染色定位β-catenin、RT-PCR及Westernblot方法分別檢測穩(wěn)/瞬轉C6細胞株細胞中Axin、p53、β-catenin的mRNA及其蛋白質的表達的變化，研究

8、過表達Axin是否類似ATRA對細胞的作用。（4）AxinRNAi片斷轉染C6細胞，流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡的變化，RT-PCR及Westernblot方法分別檢測p53等的mRNA及其蛋白質的表達的變化。探討AxinRNAi能否逆轉ATRA對膠質瘤細胞的調節(jié)。
　　結果：（1）ATRA抑制膠質瘤細胞的增殖、促進其凋亡；ATRA激活Axin、p53的表達、穩(wěn)定胞漿內β-catenin蛋白的表達而不影響其總蛋白量。（2）膠質瘤C

9、6細胞過表達Axin與ATRA的作用類似：（i）抑制細胞增殖，促其凋亡；（ii）穩(wěn)定胞漿β-catenin蛋白的表達；（iii）激活p53的表達。（3）AxinRNAi逆轉ATRA對膠質瘤C6細胞的抑制作用：促進細胞增殖，抑制細胞凋亡并抑制p53的表達。
　　結論：Axin參與ATRA介導的膠質瘤細胞的增殖抑制及促凋亡作用；ATRA激活的Axin的表達，上調抑癌基因p53的表達，并促進β-catenin的核漿穿梭，增加胞漿內β-c