Notch2在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和腫瘤形成中的作用研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是人類(lèi)最常見(jiàn)的腦腫瘤之一預(yù)后極差。近些年隨著外科技術(shù)的進(jìn)步和術(shù)后放療、化療的應(yīng)用，膠質(zhì)瘤的術(shù)后生存率雖然較前有所提高，但平均生存期仍然低于15個(gè)月。然而惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存率卻已經(jīng)顯示出了較為明顯的個(gè)體差異，個(gè)別病例的生存時(shí)間已經(jīng)可以提高到確診后5年。而且，近年來(lái)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn)也使膠質(zhì)瘤的治療產(chǎn)生了突破性的進(jìn)展，對(duì)腫瘤內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的研究衍生出針對(duì)腫瘤增殖相關(guān)的一條或多條信號(hào)通路的阻滯治療和應(yīng)用抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)

2、因子的靶向抗血管生成治療已經(jīng)初步應(yīng)用于臨床。國(guó)內(nèi)外很多大型的研究已經(jīng)使醫(yī)生對(duì)膠質(zhì)瘤形成的基因改變和分子基礎(chǔ)有了逐步的了解。相信在不久的將來(lái)，針對(duì)腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)關(guān)鍵分子通路進(jìn)行治療的綜合治療方法會(huì)減少膠質(zhì)瘤患者的死亡率和發(fā)病率。
　　 RNA干擾(RNAi)技術(shù)已經(jīng)不僅僅是研究基因功能的有力工具，它還能迅速的發(fā)現(xiàn)藥物作用的有效靶點(diǎn)，并通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)得以證實(shí)。RNAi技術(shù)的產(chǎn)生也為癌癥的治療帶來(lái)了新的理念和希望。RNAi

3、技術(shù)的本質(zhì)是通過(guò)二核苷酸法對(duì)選擇的基因進(jìn)行沉默。在生理情況下由細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生的短雙鏈RNA寡核苷酸的基因沉默效果是暫時(shí)的，不能夠達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)效果。而細(xì)胞核內(nèi)自身的基因表達(dá)序列能夠表達(dá)短發(fā)卡RNA，它能夠內(nèi)源性的干擾目的RNA并且能夠產(chǎn)生較穩(wěn)定的基因敲除效果。體外合成的目的shRNA必須要穿過(guò)生理膜屏障，還要進(jìn)行自我復(fù)制來(lái)產(chǎn)生持久的干擾效果。質(zhì)?；虿《据d體能夠很好的完成這個(gè)任務(wù)，如今已經(jīng)成為shRNA的主要載體。有了成熟的RNAi技術(shù)使我們

4、在膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制研究中能夠更加的深入和具體。
　　 近年來(lái)Notch信號(hào)在腫瘤中的作用已經(jīng)被證實(shí)，一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了腦腫瘤中Notch信號(hào)的作用，最近的研究表明Notch信號(hào)在人類(lèi)腦膠質(zhì)瘤中也發(fā)揮作用。但Notch信號(hào)在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到的具體作用還不清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法對(duì)37例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和5例腦組織標(biāo)本進(jìn)行Notch2蛋白的檢測(cè)，研究Notch2在人類(lèi)腦膠質(zhì)瘤中的意義。并應(yīng)用pGFR-Notch2-shRNA

5、干擾質(zhì)粒對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用多種方法對(duì)Notch2基因敲除后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)培養(yǎng)出穩(wěn)定的Notch2基因敲除細(xì)胞株，并應(yīng)用此細(xì)胞株建立裸鼠移植瘤模型，觀察Notch2對(duì)體內(nèi)腫瘤的生成和腫瘤生長(zhǎng)的影響，為臨床腫瘤治療提供可靠的論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)共分為四個(gè)部分。
　　 第一部分 Notch2在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)和意義研究
　　 目的：探討Notch2在人腦

6、膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義。
　　 方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)37例WHO分級(jí)Ⅰ～Ⅳ級(jí)的新鮮腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和外傷或腦出患者內(nèi)減壓手術(shù)獲得的5例腦組織標(biāo)本進(jìn)行Notch2蛋白的檢測(cè)，比較不同級(jí)別膠質(zhì)瘤和正常腦組織中Notch2蛋白表達(dá)差異，分析Notch2蛋白表達(dá)和膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：Notch2在各級(jí)人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和正常腦組織標(biāo)本中均有不同程度表達(dá)，與正常腦組織相比膠質(zhì)瘤中Notch2蛋白的表達(dá)顯著增

7、高(Z=4.69,P=0.00)，而且Notch2蛋白的表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤分級(jí)增加而增高，呈顯著的正相關(guān)（spearman相關(guān)系數(shù)=0.956，P=0.000）。
　　 結(jié)論：Notch2蛋白在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)顯著增高，而且表達(dá)隨著腫瘤分級(jí)或惡性程度的增高而增加，與膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高呈顯著的正相關(guān)。Notch2在膠質(zhì)瘤的進(jìn)展中有重要的意義，可作為腦膠質(zhì)瘤臨床分級(jí)的重要指標(biāo)。
　　 第二部分 shRNA靶向干擾Notch2

8、對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的影響研究
　　 目的：研究Notch2信號(hào)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。
　　 方法：應(yīng)用脂質(zhì)體將pGFP-V-RS Notch2 shRNA干擾質(zhì)粒導(dǎo)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251后，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化、流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的改變、RT-PCR和Westenblot檢測(cè)Notch2基因的抑制效果和干擾后細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)改變。

9、>　　 結(jié)果：pGFP-V-RS Notch2 shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率為86.68％±2.54％，轉(zhuǎn)染后在mRNA水平和蛋白水平均發(fā)生Notch2的表達(dá)抑制，與無(wú)關(guān)序列組和未轉(zhuǎn)染組相比干擾組細(xì)胞自第5天開(kāi)始增殖明顯減慢(P＜0.05)，干擾組G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（68.2％±1.29％）顯著高于無(wú)關(guān)序列組和未轉(zhuǎn)染組(35.8％±2.37％和47.7％±1.03％，P＜0.01)，而干擾組G2/S期細(xì)胞（20.4％±1.56％）顯

10、著低于無(wú)關(guān)序列組和未轉(zhuǎn)染組(49.1％±3.65％和35.4％±2.42％，P＜0.05)，干擾組細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P＜0.05)。細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白P21上調(diào)，cyclinD1、p-Rb下調(diào)。
　　 結(jié)論：Notch2靶向干擾能夠顯著抑制U251細(xì)胞株的增殖、阻滯細(xì)胞周期、增加凋亡，為腦膠質(zhì)瘤靶向治療提供可靠的依據(jù)。
　　 第三部分 Notch2shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251增殖、周期和凋亡的影響

11、研究。
　　 目的：探討穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因Notch2的短發(fā)卡RNA對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的生長(zhǎng)、增殖、凋亡的長(zhǎng)效影響。
　　 方法：利用Notch2shRNA質(zhì)粒及相同載體的無(wú)意義序列轉(zhuǎn)入U(xiǎn)251細(xì)胞，篩選的陽(yáng)性克隆細(xì)胞繼續(xù)壓力培養(yǎng)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，應(yīng)用RT-PCR、western blot檢測(cè)Notch2表達(dá)抑制情況及相關(guān)蛋白表達(dá)變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖速度，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。
　　 結(jié)果：與

12、轉(zhuǎn)染無(wú)意義序列組和未轉(zhuǎn)染組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Notch2shRNA后，Notch2的mRNA和蛋白的表達(dá)顯著抑制；干擾組第5天開(kāi)始殖明顯減慢（P＜0.05）；干擾組細(xì)胞凋亡率15.14±4.26％明顯高于對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組2.7±1.45％(P＜0.05)，干擾組S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(23.1±3.4％)顯著低于對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組（41.2±6.9％，P＜0.01），而干擾組G1期細(xì)胞（51.8±3.9％）顯著高于對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組(38.9±9.7％

13、，P＜0.05)；與對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組相比干擾組細(xì)胞增殖、周期和凋亡相關(guān)蛋白p21，p27上調(diào)，CyclinD1，MCM2下調(diào)。
　　 結(jié)論：U251細(xì)胞株中Notch2表達(dá)被長(zhǎng)效抑制后，細(xì)胞增殖抑制，凋亡增多，為腦膠質(zhì)瘤基因治療提供了新的靶點(diǎn)。
　　 第四部分 Notch2shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。
　　 目的：研究Notch2蛋白抑制的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的致瘤性及對(duì)裸鼠生存時(shí)

14、間的影響及機(jī)制。
　　 方法：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Notch2shRNA-U251細(xì)胞株、正常U251細(xì)胞株和相同載體無(wú)意義序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞株，應(yīng)用皮下注射的方法分別建立裸鼠皮下移植瘤模型每組各10只，定期測(cè)量腫瘤大小，繪制生長(zhǎng)曲線，比較裸鼠生存時(shí)間，移植后40天每組處死4只裸鼠，稱(chēng)重標(biāo)本計(jì)算腫瘤抑制率，并對(duì)瘤標(biāo)本進(jìn)行Notch2免疫組化檢測(cè)。
　　 結(jié)果：與未轉(zhuǎn)染組和無(wú)意義序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組相比，Notch2

15、 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組裸鼠腫瘤體積顯著減小，從第35天開(kāi)始存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=6.336，P=0.003)，40天后取材顯示，未轉(zhuǎn)染組和無(wú)意義序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組平均瘤重分別為(1.375±0.236)g，(1.231±0.558)g顯著大于Notch2 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組(0.372±0.079)g，（F=7.862，P＜0.01），與未轉(zhuǎn)染組和無(wú)意義序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組比較，Notch2 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組腫瘤抑制率達(dá)69.8～72.9％％

16、。未轉(zhuǎn)染組和無(wú)意義序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組裸鼠均在腫瘤移植后88天內(nèi)相繼死亡，內(nèi)平均生存時(shí)間分別72±3天和73±4天，Notch2 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組裸鼠至130觀察結(jié)束時(shí)仍有3只裸鼠存活，平均生存時(shí)間112±8天，生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)。免疫組化顯示與未轉(zhuǎn)染組和無(wú)意義序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組相比Notch2 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組裸鼠瘤組織標(biāo)本中Notch2水平顯著降低(Z=9.87．P=0.00)。
　　 結(jié)論：U251細(xì)胞株中Notch2蛋白顯著