CPEB4在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株增殖、凋亡和侵襲力的影響.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤，約占成人顱內(nèi)腫瘤的35.26％-60.96％(平均44.69％)。由于其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，在腫瘤與正常組織之間常無(wú)明顯的邊界，因此手術(shù)治療難以徹底切除腫瘤組織。盡管我們努力嘗試各種治療方法，但是腦膠質(zhì)瘤仍然無(wú)法治愈。這就要求我們?yōu)槟z質(zhì)瘤的治療尋找新的策略。近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們開(kāi)始從分子生物學(xué)的角度探求腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，腦膠質(zhì)瘤的基因治療逐漸受到關(guān)注。CPEB4是新近發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì)多聚腺

2、苷酸化元件結(jié)合蛋白(CPEBs)家族中的一員，是一種具有序列特異性的RNA結(jié)合蛋白，含有一個(gè)RNA識(shí)別基序和一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，位于人染色體5q21區(qū)域，定位于細(xì)胞質(zhì)，長(zhǎng)度為7769bp。胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白(CPEBs)于大約二十年前被首次發(fā)現(xiàn)在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，其在已確定的信使RNA的翻譯過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，人們?cè)谠缙谧隽撕芏嚓P(guān)于CPEB控制胞質(zhì)多聚腺苷酸化和翻譯的工作，發(fā)現(xiàn)CPEB通過(guò)調(diào)控mRNA這一活動(dòng)而影響諸多進(jìn)程如

3、生殖細(xì)胞的發(fā)育、細(xì)胞分裂與細(xì)胞衰老、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)與記憶等。然而，關(guān)于近年CPEBs的一些熱點(diǎn)研究表明它不僅在體細(xì)胞組織表達(dá)，而且在控制成年有機(jī)體時(shí)間和空間的基因表達(dá)方面具有重要的功能。這些新發(fā)現(xiàn)的功能包括調(diào)節(jié)衰老和增殖之間的平衡，及腫瘤的發(fā)生等。CPEBs在各種組織和腫瘤中高度表達(dá)，且有部分重疊。最近的一項(xiàng)新研究表明，CPEB4在胰腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高度表達(dá)，這與腫瘤的生長(zhǎng)、惡性度的增加及血管生成等有關(guān)。然而，CPEB4在腦膠質(zhì)

4、瘤中的表達(dá)沒(méi)有被詳細(xì)描述。
　　鑒于以上研究背景，我們通過(guò)施行免疫組織化學(xué)、蛋白免疫印跡以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)了CPEB4在正常腦組織和不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤的蛋白及RNA水平的表達(dá)情況。此外，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)敲減膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中CPEB4的表達(dá)，來(lái)探究其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲中的作用。本實(shí)驗(yàn)研究包括以下三個(gè)部分:
　　第一部分、CPEB4在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的:探討CPEB4在

5、正常腦組織中和各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況。
　　方法:
　　1.收集樣本:收集2011年10月至2012年11月期間在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院住院，經(jīng)行手術(shù)切除的63例腦膠質(zhì)瘤組織及9例正常腦組織。腫瘤標(biāo)本均由神經(jīng)病理醫(yī)師確診，正常腦組織取自腦出血或腦外傷需行內(nèi)減壓術(shù)的患者。每例患者分兩部分留取標(biāo)本，一部分置于10％福爾馬林液中固定，另一部分保存于2ml無(wú)菌凍存管并立即投至液氮中速凍。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè):

6、9例正常腦組織及63例膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中CPEB4蛋白的表達(dá)情況，并比較其表達(dá)差異，分析其與腦膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的相關(guān)性。
　　3.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time qPCR)測(cè)定CPEB4 mRNA的表達(dá)水平。
　　4.應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡Western blot檢測(cè)正常腦組織及膠質(zhì)瘤組織中CPEB4蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組織化學(xué)結(jié)果:CPEB4在膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中的總陽(yáng)性表達(dá)率為88.8

7、9％(56/63)，CPEB4在9例正常腦組織中表達(dá)呈陰性或很弱，腦膠質(zhì)瘤組織的CPEB4陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常腦組織，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);低級(jí)別（Ⅰ、Ⅱ級(jí)）和高級(jí)別（Ⅲ、Ⅳ級(jí)）膠質(zhì)瘤組織陽(yáng)性表達(dá)率分別為75％(15/20)和95.4％(41/43)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.Western blot結(jié)果:CPEB4蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常腦組織。 CPEB4蛋白在正常腦組織及Ⅰ

8、、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤中相對(duì)表達(dá)量分別為0.070±0.012，0.417±0.044，0.495±0.043，0.709±0.080，0.713±0.027。CPEB4蛋白在低級(jí)別（Ⅰ、Ⅱ級(jí)）腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)量低于高級(jí)別（Ⅲ、Ⅳ級(jí)）(P＜0.05)。
　　3.Real-time qPCR結(jié)果:CPEB4mRNA在正常腦組織、低級(jí)別及高級(jí)別中相對(duì)表達(dá)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.免疫組化與Wes

9、tern blot檢測(cè)均得出CPEB4蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織中高度表達(dá)，并且其表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高而增加，Ⅲ、Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤中CPEB4蛋白表達(dá)要高于Ⅰ、Ⅱ級(jí)腦膠質(zhì)瘤，差異顯著;但是，在mRNA水平，CPEB4的表達(dá)卻無(wú)明顯差異。對(duì)于這種蛋白水平與RNA水平表達(dá)不一致的情況，我們分析可能是與此RNA的穩(wěn)定性差、易降解有關(guān)。
　　2.CPEB4的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高呈顯著的正相關(guān)，可作為腦膠質(zhì)瘤臨床分級(jí)的重要指標(biāo)。
　

10、　第二部分、 CPEB4在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251中的表達(dá)
　　目的:檢測(cè)CPEB4在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87和U251中的表達(dá)情況，選出CPEB4表達(dá)量較高的細(xì)胞株以進(jìn)行進(jìn)一步的生物學(xué)功能試驗(yàn)。
　　方法:
　　1.應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡Western blot檢測(cè)U87和U251細(xì)胞中CPEB4蛋白表達(dá)情況。
　　2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time qPCR)測(cè)定U87和U251細(xì)胞中CP

11、EB4mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87的CPEB4蛋白和mRNA均高于U251(P＜0.05)。
　　結(jié)論:U87細(xì)胞株可被選擇作為CPEB4的優(yōu)勢(shì)表達(dá)株，進(jìn)一步行以CPEB4為研究靶點(diǎn)的生物學(xué)功能試驗(yàn)。
　　第三部分、CPEB4慢病毒載體感染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87及其對(duì)U87細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲力的影響研究
　　目的:構(gòu)建CPEB4干擾慢病毒載體，以構(gòu)建好的CPEB4siRNA干擾慢病毒載體感

12、染U87細(xì)胞株，探討RNA干擾(RNAinierference，RNAi)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87中CPEB4表達(dá)的抑制作用及其對(duì)U87細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲力的影響。
　　方法:
　　1.構(gòu)建CPEB4干擾慢病毒載體:針對(duì)目的基因CPEB4的序列信息，嚴(yán)格按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)3個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列，合成SiRNA并向U87細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染3種si RNA，利用western blot篩選干擾效果最佳的siRNA，根據(jù)此s

13、iRNA序列，合成雙鏈DNA Oligo，兩端帶有BamHⅠ和ECORⅠ酶切位點(diǎn)粘性末端，退火后得到的雙鏈產(chǎn)物無(wú)需酶切可直接連入BamHⅠ和ECORⅠ線性化的pSRL-SIH1-H1-GFP載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，提取細(xì)菌培養(yǎng)物中的質(zhì)粒，對(duì)長(zhǎng)出的克隆抽提質(zhì)粒并酶切鑒定，然后進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，鑒定陽(yáng)性克隆即為構(gòu)建成功的CPEB4 RNA干擾慢病毒載體。
　　2.在體外應(yīng)用RNA干擾技術(shù)以siCPEB4(CPEB4 SiRNA

14、)靶向感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87，分為轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組;
　　3.應(yīng)用Western blot和Real time qPCR分別檢測(cè)CPEB4-siRNA慢病毒感染U87細(xì)胞后1天、2天、3天、4天、5天細(xì)胞中CPEB4蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量變化;
　　4.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)CPEB4 SiRNA慢病毒感染U87細(xì)胞后的細(xì)胞周期變化，并檢測(cè)分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡水平變化;
　　5.應(yīng)用MTT比色實(shí)

15、驗(yàn)檢測(cè)分析感染CPEB4-SiRNA慢病毒1天、2天、3天、4天、5天、6天及7天后U87細(xì)胞的增殖情況;
　　6.應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞體外侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建并包裝了攜帶CPEB4基因的慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)陽(yáng)性克隆測(cè)序證實(shí)插入序列完全正確;
　　2.Western blot和Real time qPCR結(jié)果顯示，慢病毒感染組的CPEB4蛋白和mRNA相對(duì)表

16、達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組間表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，相對(duì)于陰性對(duì)照組細(xì)胞以及空白對(duì)照組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染CPEB4 siRNA慢病毒后U87細(xì)胞阻滯于G1期，S期細(xì)胞數(shù)相對(duì)較少;陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的U87細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞周期沒(méi)有變化;流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的凋亡水平顯示，相對(duì)于空白對(duì)照組細(xì)胞（0.13±0.08）

17、％和陰性對(duì)照組細(xì)胞（0.47±0.12）％，U87細(xì)胞感染CPEB4 si-RNA慢病毒后早期凋亡率增加，達(dá)(19.16±3.85)％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);
　　4.MTT檢測(cè)細(xì)胞活性顯示，從第三天起，與陰性對(duì)照組(0.476±0.048)和未轉(zhuǎn)染組（0.495±0.031）相比，慢病毒感染組（0.42±0.05）細(xì)胞生長(zhǎng)速度開(kāi)始減慢，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，且隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制程度越來(lái)越明顯。而未轉(zhuǎn)染組

18、與陰性對(duì)照組組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。說(shuō)明CPEB4 siRNA對(duì)U87細(xì)胞生長(zhǎng)增殖具有顯著抑制作用;
　　5.Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)CPEB4 siRNA慢病毒感染后，U87細(xì)胞穿膜數(shù)量明顯減少，低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。換句話(huà)說(shuō)，CPEB4能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外侵襲力。
　　結(jié)論:CPEB4靶向轉(zhuǎn)染能夠有效敲減這個(gè)基因在人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能