下調(diào)膠質(zhì)瘤干細胞CXCR4表達對膠質(zhì)瘤侵襲和血管生成能力的影響.pdf

1、隨著干細胞研究領(lǐng)域的飛速發(fā)展和實驗技術(shù)的進步，“腫瘤干細胞”理論再次引起人們的關(guān)注，并為越來越多的學(xué)者所接受。該理論認為：腫瘤是一個異質(zhì)性的群體，只有腫瘤干細胞亞群具備自我更新、多向分化以及成瘤能力，而非腫瘤干細胞(包括祖細胞、分化的腫瘤細胞)則缺乏這些能力。研究者先后在白血病、乳腺癌、腦腫瘤、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌等至少20類腫瘤中證實了腫瘤干細胞的存在，并對其多種重要的生物學(xué)特性進行了細致的觀察，包括治療抵抗性、促血管生成能力、侵襲

2、特性、免疫源性等。隨著研究的深入，越來越多的研究者相信，這群數(shù)量稀少、性質(zhì)特殊的細胞，才是惡性腫瘤發(fā)生、進展以及治療后復(fù)發(fā)的根源，而探索針對腫瘤干細胞亞群的靶向治療措施，是今后惡性腫瘤治療的重要方向之一。 趨化因子受體CXCR4屬于7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體家族，可被其特異性配體SDF-1激活。CXCR4在多種腫瘤中都具有很強的促侵襲和促血管生成能力。在膠質(zhì)瘤中，CXCR4的表達與腫瘤的級別呈正相關(guān)，其活化后可促進膠質(zhì)瘤細胞侵襲，

3、并且活化后還可以通過上調(diào)膠質(zhì)瘤細胞VEGF的分泌量來促進腫瘤的血管生成。近期的研究表明，從原代膠質(zhì)瘤標本中獲取的膠質(zhì)瘤干細胞高表達CXCR4。然而CXCR4在膠質(zhì)瘤干細胞中的作用尚需進一步研究。 在本研究中，首先，采用間接免疫熒光標記驗證U87細胞及其顱內(nèi)移植瘤標本中膠質(zhì)瘤干細胞標記物CD133是否和CXCR4共表達。然后，我們采用si-RNA(小干擾RNA)下調(diào)U87細胞中CXCR4的表達，并且分別從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CXCR4小干擾R

4、NA質(zhì)粒的U87細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的U87細胞中培養(yǎng)出膠質(zhì)瘤干細胞球，并對其進行鑒定，同時觀察兩者CXCR4的表達情況。在此基礎(chǔ)上我們進一步通過Transwell小室比較兩者的侵襲能力；采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測兩者細胞培養(yǎng)上清內(nèi)VEGF的含量。我們還采用上述膠質(zhì)瘤干細胞的裸鼠顱內(nèi)移植瘤，在體內(nèi)觀察其VEGF的分泌的情況和腫瘤的微血管密度的差別。主要的結(jié)果和結(jié)論如下： 1.U87細胞中膠質(zhì)瘤干細胞的CXCR4

5、表達情況 用免疫熒光標記U87細胞及其瘤顱內(nèi)移植瘤標本，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察CXCR4和CD133的表達情況。結(jié)果顯示，U87細胞及其建立的顱內(nèi)移植瘤中均可以檢測到CD133和CXCR4雙陽性的膠質(zhì)瘤干細胞 2.獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CXCR4干擾質(zhì)粒的U87細胞 獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞后，我們對干擾效果進行檢測了檢測。Western blot結(jié)果顯示，干擾組1細胞的CXCR4表達水平下降較明顯；干擾組2略有下降；而干擾組

6、3則幾乎沒有效果。我們選用干擾組1進行后續(xù)試驗，并用RT-PCR對其干擾效果從RNA水平進行了進一步的檢驗，結(jié)果表明干擾組CXCR4水平顯著下降。 3.膠質(zhì)瘤干細胞球的篩選和鑒定 (1)用逐漸添加神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)基的方法，成功地分別從干擾組與對照組U87細胞中培養(yǎng)出膠質(zhì)瘤干細胞球。在于細胞培養(yǎng)基中，分化的腫瘤細胞貼壁并且生長受到抑制，而GSCs能夠在培養(yǎng)基中呈克隆球樣懸浮生長。 (2)兩組膠質(zhì)瘤干細胞球均表達膠

7、質(zhì)瘤干細胞的標記物CD133和nestin，并且從干擾組U87細胞中獲得的膠質(zhì)瘤干細胞球，其CXCR4的表達較對照組明顯降低。 4.下調(diào)CXCR4表達對膠質(zhì)瘤干細胞趨化和侵襲能力的影響 (1)下調(diào)膠質(zhì)瘤干細胞CXCR4表達后，體外趨化結(jié)果顯示，干擾組的膠質(zhì)瘤干細胞轉(zhuǎn)移至微孔膜下表面的細胞數(shù)明顯少于對照組。在每個高倍鏡視野下，干擾組僅有60±7.3個細胞穿過微孔轉(zhuǎn)移至膜的下方，對照組卻有166±11.2個細胞轉(zhuǎn)移至膜的下方

8、(P<0.05)。 (2)體外侵襲試驗結(jié)果顯示，干擾組的膠質(zhì)瘤干細胞轉(zhuǎn)移至微孔膜下表面的細胞數(shù)也少于對照組。干擾組為：17±5.8個/HPF，對照組為：71±8.7個/HPF(P<0.05)。 5.下調(diào)CXCR4表達抑制膠質(zhì)瘤干細胞分泌VEGF (1)分別在24 h、48 h時用ELISA檢測各組膠質(zhì)瘤干細胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量。結(jié)果顯示，下調(diào)膠質(zhì)瘤干細胞CXCR4表達后，其VEGF的分泌量也隨之降低。在24

9、 h時干擾組和對照組VEGF的分泌量分別為690+24 pg/ml和850±25 pg/ml(P<0.05)，在48 h時干擾組和對照組VEGF的分泌量分別為1504±53 pg/ml和2001±150 pg/ml(P<0.05)。 (2)我們在進一步在體內(nèi)對其進行驗證。結(jié)果顯示：干擾組膠質(zhì)瘤干細胞建立的顱內(nèi)移植瘤的微血管密度和VEGF的分泌量均小于對照組。 綜上所述，U87細胞中的膠質(zhì)瘤干細胞上表達CXCR4，從干擾的

10、U87細胞中可以培養(yǎng)出膠質(zhì)瘤干細胞，它們也表達膠質(zhì)瘤干細胞的標記物，而且從干擾組中培養(yǎng)出的膠質(zhì)瘤干細胞的CXCR4表達水平要低于對照組；此外，干擾組的膠質(zhì)瘤干細胞的趨化和侵襲能力下降，同時其分泌VEGF的能力也低于對照組，并且干擾組膠質(zhì)瘤干細胞建立的裸鼠顱內(nèi)移植瘤模型中微血管密度和VEGF的分泌量也低于對照組。結(jié)果提示下調(diào)膠質(zhì)瘤干細胞的CXCR4表達可以抑制膠質(zhì)瘤干細胞的趨化和侵襲，并且可以下調(diào)其促血管生成能力。提示：CXCR4可能是膠