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文檔簡介
1、膠質(zhì)細(xì)胞瘤是一種顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤,其發(fā)病率高,占所有顱內(nèi)腫瘤的50%以上。由于膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長,侵襲性強(qiáng),所以手術(shù)難以完全切除,治療效果差,往往預(yù)后不良。WHO將膠質(zhì)瘤分為4級(jí),級(jí)別越高則惡性程度就越高。其中級(jí)別最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)為WHOⅣ級(jí),該腫瘤發(fā)病率高,約占到所有顱內(nèi)腫瘤的15%。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤盡可能手術(shù)切除的前提下,再輔以標(biāo)準(zhǔn)的放化療,病人的中位生存期仍然不超過15個(gè)月。
近年來的研究表明,膠質(zhì)瘤,特別是惡性
2、程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中含有一種細(xì)胞亞群,這種細(xì)胞亞群擁有部分正常干細(xì)胞的特性,被稱為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioblastoma stem-like cells,GSCs)。GSCs起到了極強(qiáng)的促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖的作用,同時(shí)GSCs在促進(jìn)腫瘤向顱內(nèi)周圍腦組織浸潤、擴(kuò)散的過程中起到了關(guān)鍵作用。目前手術(shù)綜合放化療并不能有效的殺滅GSCs,這導(dǎo)致腫瘤往往會(huì)較快復(fù)發(fā),預(yù)后不良,所以亟需探索能夠有效殺滅GSCs的治療手段。
褪黑素是一種由
3、松果體分泌的激素。長期以來,褪黑素一直被認(rèn)為是一種調(diào)節(jié)生物節(jié)律的激素,而近年來越來越多的研究證明,褪黑素對(duì)多種腫瘤均具有抑制作用,其中便包括膠質(zhì)瘤。然而褪黑素對(duì)GSCs的作用還少有研究,其機(jī)制也尚不明確。
EZH2具有組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶作用,是多梳蛋白復(fù)合體2的組分之一。在包括膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中,均發(fā)現(xiàn)了EZH2的異常升高。并且EZH2的表達(dá)量越高,腫瘤往往惡性程度越高,預(yù)后越發(fā)不良,而抑制EZH2的
4、表達(dá)能夠延緩腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)已經(jīng)有確切證據(jù)表明,EZH2是GSCs的干性指標(biāo)之一。NOTCH受體的過表達(dá)也存在于包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中。EZH2-NOTCH1信號(hào)軸已經(jīng)被證明存在于胰腺癌中,而EZH2-NOTCH1信號(hào)軸是否也存在于GSCs中,同時(shí)是否參與了褪黑素對(duì)GSCs的作用還尚沒有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要研究了褪黑素對(duì)GSCs的作用及具體的作用機(jī)制。
目的:
1、研究褪黑素對(duì)GSCs增殖、自我更新及干性的
5、作用;
2、研究EZH2-NOTCH1信號(hào)軸在褪黑素起效過程中發(fā)揮的具體作用;
3、研究EZH2對(duì)NOTCH1調(diào)控中的具體作用機(jī)制。
方法:
第一部分:褪黑素對(duì)GSCs增殖、自我更新及干性的影響
1、U251和T98細(xì)胞系中GSCs的培養(yǎng)及驗(yàn)證
1.1在干細(xì)胞富集培養(yǎng)基(無血清,加入B27, bFGF和EGF因子)培養(yǎng)U251和T98G細(xì)胞系,培養(yǎng)至少三周,建立GSCU251和
6、GSCT98G細(xì)胞模型。
1.2 qRT-PCR檢測(cè)GSCs干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和SOX2的含量,驗(yàn)證GSCU251和GSCT98G細(xì)胞模型是否建立成功。
2、檢測(cè)不同濃度褪黑素對(duì)GSCs的生存、增殖能力的影響
2.1配制含有不同濃度褪黑素(0.1-1000μM)的培養(yǎng)基,培養(yǎng)GSCU251和GSCT98G。
2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度褪黑素對(duì)GSCU251和GSCT98G增殖能力的影響
7、。
3、檢測(cè)褪黑素其對(duì)GSCs自我更新能力的影響
通過成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)不同濃度褪黑素對(duì)GSCU251和GSCT98G自我更新能力的影響。
4、檢測(cè)褪黑素對(duì)GSCs干性的影響
qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)褪黑素對(duì)GSCU251和GSCT98G中干性標(biāo)記物CD133和SOX2表達(dá)的影響。
第二部分:EZH2在褪黑素對(duì)GSCs的抑制過程中的作用探究
1、檢測(cè)褪黑素對(duì)GSC
8、s中EZH2表達(dá)的影響。
qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)褪黑素對(duì)GSCs中EZH2表達(dá)的影響。
2、EZH2敲除GSCU251模型的建立
2.1通過EZH2 shRNA轉(zhuǎn)染GSCU251,建立EZH2敲除GSCU251模型。
2.2 Western Blot檢測(cè)EZH2敲除GSCU251模型建立是否成功。
3、檢測(cè)EZH2敲除后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的
9、變化
敲除GSCU251中的EZH2后,CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GSCU251的生長、增殖能力變化;成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)GSCU251的自我更新能力變化;qRT-PCR檢測(cè)GSCU251中CD133分子表達(dá)的變化。
4、EZH2過表達(dá)GSCU251模型的建立
4.1通過GV230-EZH2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GSCU251,中建立EZH2過表達(dá)GSCU251模型。
4.2 Western Blot檢測(cè)EZH2過表達(dá)GSCU
10、251模型建立是否成功。
5、檢測(cè)EZH2過表達(dá)后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的變化
GSCU251中的EZH2過表達(dá)后,CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GSCU251的生長、增殖能力變化;成球試驗(yàn)檢測(cè)GSCU251的自我更新能力變化;qRT-PCR檢測(cè)GSCU251中CD133分子表達(dá)的變化。
6、檢測(cè)褪黑素加入后,對(duì)照組和EZH2過表達(dá)組GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的變化
6
11、.1在對(duì)照組GSCU251中加入褪黑素進(jìn)行培養(yǎng),CCK-8、成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)GSCU251的增殖能力、自我更新能力變化; qRT-PCR檢測(cè)GSCU251中CD133分子表達(dá)的變化。
6.2在EZH2過表達(dá)組GSCU251中加入褪黑素進(jìn)行培養(yǎng),CCK-8、成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)GSCU251的增殖能力、自我更新能力變化; qRT-PCR檢測(cè)GSCU251中CD133分子表達(dá)的變化。
第三部分:NOTCH1在EZH2起效過程中的作用
12、及機(jī)制
1、檢測(cè)褪黑素對(duì)GSCs中NOTCH1表達(dá)的影響
1.1 qRT-PCR檢測(cè)褪黑素干預(yù)后GSCU251和GSCT98G中NOTCH1及下游因子CCND1,CCNE2和HES1等的mRNA表達(dá)量變化。
1.2 Western Blot檢測(cè)褪黑素干預(yù)后GSCU251和GSCT98G中NICD1(NOTCH1的胞內(nèi)功能區(qū)域)和HES1的蛋白表達(dá)量變化。
2、檢測(cè)EZH2對(duì)NOTCH1的調(diào)控作用<
13、br> 2.1通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EZH2敲除和過表達(dá)GSCU251中NOTCH1轉(zhuǎn)錄活性的變化。
2.2 Western Blot檢測(cè)EZH2敲除和過表達(dá)GSCU251中NICD1和HES1的蛋白表達(dá)量變化。
2.3染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GSCU251中NOTCH1的啟動(dòng)子位置EZH2、H3K27me3和SUZ12的聚集情況。
第四部分:EZH2-NOTCH1信號(hào)軸在臨床樣本中的初步探究
14、 1、檢測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本和正常腦組織樣本中EZH2和NICD1表達(dá)的相關(guān)性
1.1選取67例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本和12例正常腦組織樣本進(jìn)行EZH2和NICD1指標(biāo)的免疫組化染色。
1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中EZH2和NICD1的表達(dá)相關(guān)性。
結(jié)果:
第一部分:褪黑素對(duì)GSCs增殖、自我更新及干性的影響
1、U251和T98細(xì)胞系中GSCs的培養(yǎng)及驗(yàn)證
通過干細(xì)胞富集培養(yǎng)
15、基培養(yǎng)U251和T98G細(xì)胞系三周后,建立GSCU251和GSCT98G細(xì)胞模型。通過qRT-PCR檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn),與普通U251和T98G細(xì)胞系相比,GSCU251和GSCT98G細(xì)胞模型的干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和SOX2的含量明顯升高。
2、檢測(cè)不同濃度褪黑素對(duì)GSCs的生存、增殖能力的影響
不同濃度褪黑素處理GSCU251和GSCT98G后,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,100μM和1mM的褪黑素對(duì)GSCs的生長產(chǎn)生
16、了抑制作用。
3、檢測(cè)褪黑素其對(duì)GSCs自我更新能力的影響
不同濃度褪黑素處理GSCU251和GSCT98G后,成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,100μM和1mM的褪黑素對(duì)GSCs的自我更新產(chǎn)生了抑制作用。
4、檢測(cè)褪黑素對(duì)GSCs干性的影響
qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明,1mM的褪黑素對(duì)GSCU251和GSCT98G中干性標(biāo)記物CD133和SOX2表達(dá)有明顯的抑制作用。
第二
17、部分:EZH2在褪黑素對(duì)GSCs的抑制過程中的作用探究
1、檢測(cè)褪黑素對(duì)GSCs中EZH2表達(dá)的影響。
qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明,褪黑素的干預(yù)顯著降低了GSCU251和GSCT98G中EZH2的表達(dá)量。
2、EZH2敲除GSCU251模型的建立
通過EZH2 shRNA轉(zhuǎn)染GSCU251,建立EZH2敲除GSCU251模型后,Western Blot實(shí)驗(yàn)表明,EZH2敲
18、除GSCU251模型中的EZH2蛋白表達(dá)量明顯降低。
3、檢測(cè)EZH2敲除后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的變化
敲除GSCU251中的EZH2后,CCK-8實(shí)驗(yàn)表明,GSCU251的生長、增殖能力顯著降低;成球?qū)嶒?yàn)表明,GSCU251的自我更新能力顯著降低;qRT-PCR檢測(cè)顯示,GSCU251中CD133分子表達(dá)量顯著下降。
4、EZH2過表達(dá)GSCU251模型的建立
通過GV2
19、30-EZH2轉(zhuǎn)染GSCU251,建立EZH2過表達(dá)GSCU251模型后,Western Blot實(shí)驗(yàn)表明,EZH2過表達(dá)GSCU251模型中的EZH2蛋白表達(dá)量明顯升高。
5、檢測(cè)EZH2過表達(dá)后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的變化
GSCU251中的EZH2過表達(dá)后,CCK-8實(shí)驗(yàn)表明,GSCU251的生長、增殖能力顯著增強(qiáng);成球?qū)嶒?yàn)表明,GSCU251的自我更新能力顯著增強(qiáng);qRT-PCR檢測(cè)顯示
20、,GSCU251中CD133分子表達(dá)量顯著升高。
6、檢測(cè)褪黑素加入后,對(duì)照組和EZH2過表達(dá)組GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的變化
6.1對(duì)照組GSCU251中加入褪黑素進(jìn)行培養(yǎng)后,CCK-8、成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,GSCU251的增殖能力、自我更新能力顯著下降;qRT-PCR檢測(cè)表明,GSCU251中CD133的表達(dá)量明顯降低。
6.2 EZH2過表達(dá)組GSCU251中加入褪黑素進(jìn)行培養(yǎng)后,C
21、CK-8、成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,GSCU251的增殖能力、自我更新能力顯著下降;qRT-PCR檢測(cè)表明,GSCU251中CD133的表達(dá)量明顯降低。
第三部分:NOTCH1在EZH2起效過程中的作用及機(jī)制
1、檢測(cè)褪黑素對(duì)GSCs中NOTCH1表達(dá)的影響
1.1 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,褪黑素干預(yù)后GSCU251和GSCT98G中NOTCH1及下游因子CCND1,CCNE2和HES1等的mRNA表達(dá)量顯著下
22、降。
1.2 Western Blot檢測(cè)結(jié)果也表明,褪黑素干預(yù)后GSCU251和GSCT98G中NICD1和HES1的蛋白表達(dá)量顯著下降。
2、檢測(cè)EZH2對(duì)NOTCH1的調(diào)控作用
2.1通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn),GSCU251中的EZH2敲除和過表后,NOTCH1轉(zhuǎn)錄活性隨之減弱和增強(qiáng)。
2.2 Western Blot結(jié)果表明,GSCU251中EZH2敲除和過表達(dá)后,NICD1和HE
23、S1的蛋白表達(dá)量也隨之升高和降低。
2.3染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),GSCU251中NOTCH1的啟動(dòng)子位置可以檢測(cè)到EZH2的顯著聚集,而并未檢測(cè)到H3K27me3和SUZ12的聚集。同時(shí),褪黑素的干預(yù)顯著降低了EZH2在NOTCH1的啟動(dòng)子區(qū)域的聚集。
第四部分:EZH2-NOTCH1信號(hào)軸在臨床樣本中的初步探究
1、檢測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本和正常腦組織樣本中EZH2和NICD1表達(dá)的相關(guān)性
24、1.1免疫組化染色結(jié)果顯示,73%的EZH2高表達(dá)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中也存在著NICD1的高表達(dá)。
1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中EZH2和NICD1的表達(dá)存在高度的正相關(guān)。
結(jié)論:
1、特定濃度的褪黑素對(duì)GSCs增殖、自我更新能力具有顯著地抑制作用,并能顯著降低GSCs的干性。
2、通過機(jī)制實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn),褪黑素通過抑制EZH2-NOTCH1信號(hào)軸發(fā)揮了抑制GSCs的作用。
3
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