轉(zhuǎn)錄因子PAX3對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物學(xué)作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分：轉(zhuǎn)錄因子PAX3在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)及生物學(xué)作用
　　目的：
　　轉(zhuǎn)錄因子PAX3作為配對盒轉(zhuǎn)錄子家族一員，其不僅在神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，而且在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。我們前期工作中發(fā)現(xiàn)PAX3在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)，且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度密切相關(guān)。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞作為種子細(xì)胞是膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、治療失敗和復(fù)發(fā)的根源。本部分旨在研究轉(zhuǎn)錄

2、因子PAX3在人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中表達(dá)及對人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲及分化等生物學(xué)行為的影響，進一步探討其在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。
　　方法：
　　1、對人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞系GSC11進行細(xì)胞培養(yǎng)及干細(xì)胞鑒定。通過單克隆實驗驗證膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的克隆形成能力。
　　2、采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)與免疫印跡技術(shù)(Western Blot)檢測人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞系GSC11、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及人

3、腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系1800中轉(zhuǎn)錄因子PAX3的表達(dá)。
　　3、通過轉(zhuǎn)染PAX3真核過表達(dá)質(zhì)粒及小分子干擾RNA技術(shù)(siRNA)分別對GSC11細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子PAX3進行過表達(dá)和干擾表達(dá)，采用RT-PCR和Western Blot檢測過表達(dá)和干擾效果。采用Western Blot檢測干擾PAX3表達(dá)后對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133及Nestin表達(dá)的影響。流式細(xì)胞儀檢測GSC11細(xì)胞凋亡率;CCK-8法檢測GSC11細(xì)胞增殖能力;微

4、孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)（Transwell小室實驗）檢測GSC11細(xì)胞侵襲能力;建立膠質(zhì)瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型，采用細(xì)胞免疫熒光法檢測對GSC11細(xì)胞分化的影響。
　　結(jié)果：
　　1、細(xì)胞免疫熒光檢測顯示GSC11細(xì)胞中CD133和Nestin表達(dá)陽性，單克隆實驗證實細(xì)胞具有良好的克隆形成能力，懸浮生長的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞聚集成球。
　　2、RT-PCR與Western Blot發(fā)現(xiàn)GSC11細(xì)胞與U87細(xì)胞中PAX

5、3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于1800細(xì)胞。
　　3、轉(zhuǎn)染或者干擾后GSC11細(xì)胞中的PAX3的mRNA及蛋白表達(dá)水平較對照組明顯增高或者降低。
　　4、干擾PAX3表達(dá)后GSC11細(xì)胞中CD133及Nestin表達(dá)水平明顯下降。
　　5、過表達(dá)PAX3后明顯抑制GSC11細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖能力明顯增強，且細(xì)胞侵襲能力顯著提高;而抑制PAX3表達(dá)則明顯促進GSC11細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖能力明顯下降，且細(xì)胞侵襲能力顯

6、著降低。
　　6、細(xì)胞免疫熒光法發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PAX3的GSC11細(xì)胞分化明顯減弱，GFAP陽性細(xì)胞率顯著降低;而抑制PAX3表達(dá)的GSC11細(xì)胞分化明顯增強，GFAP陽性細(xì)胞率顯著升高。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化過程中轉(zhuǎn)錄因子PAX3表達(dá)與GFAP陽性細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　轉(zhuǎn)錄因子PAX3在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中呈高表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子PAX3表達(dá)與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為密切相關(guān)。抑制PAX3的表達(dá)可促進膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡與分化，抑制

7、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖與侵襲能力。轉(zhuǎn)錄因子PAX3有望成為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞治療新的靶分子。
　　第二部分：轉(zhuǎn)錄因子PAX3對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中膠質(zhì)纖維酸性蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制
　　目的：膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞中主要的中間纖維素蛋白，參與構(gòu)成細(xì)胞骨架，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多能干細(xì)胞向星形細(xì)胞分化的過程中起著關(guān)鍵作用，GFAF基因表達(dá)功能狀態(tài)對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)

8、功能也有重要影響。本文第一部分研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向星型膠質(zhì)細(xì)胞分化過程中轉(zhuǎn)錄因子PAX3與GFAP陽性細(xì)胞率呈負(fù)相關(guān)。本部分旨在進一步研究轉(zhuǎn)錄因子PAX3對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中GFAP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。
　　方法：
　　1、采用RT-PCR與Western Blot檢測人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞系GSC11、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及人腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系1800中GFAP的表達(dá)。
　　2、RT-PCR與Western Blot檢測轉(zhuǎn)

9、染過表達(dá)PAX3及siRNA干擾降低PAX3表達(dá)后GSC11細(xì)胞中GFAP表達(dá)，并分析PAX3與GFAP表達(dá)相關(guān)性。
　　3、通過染色質(zhì)免疫共沉淀法(CHIP Assay)檢測轉(zhuǎn)錄因子PAX3在GSC11細(xì)胞中與GFAP基因啟動子相應(yīng)區(qū)域結(jié)合情況。
　　4、予以構(gòu)建正常及突變的人GFAP啟動子報告基因質(zhì)粒，通過熒光素酶報告分析系統(tǒng)(Luciferase Assay)檢測轉(zhuǎn)錄因子PAX3對GFAP基因啟動子相應(yīng)結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)

10、控活性。
　　5、依據(jù)測得的GFAP基因啟動子PAX3轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點來設(shè)計探針序列，采用電泳遷移率試驗(EMSA)進一步驗證轉(zhuǎn)錄因子PAX3與GFAP基因啟動子相應(yīng)位點結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　1、RT-PCR與Western Blot發(fā)現(xiàn)GSC11細(xì)胞與U87細(xì)胞中GFAP的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于1800細(xì)胞。
　　2、轉(zhuǎn)染過表達(dá)PAX3后GSC11細(xì)胞中GFAP的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降，而si

11、RNA干擾降低PAX3表達(dá)后GSC11細(xì)胞中GFAP的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子PAX3表達(dá)與GFAP表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　3、ChIP實驗結(jié)果證實轉(zhuǎn)錄因子PAX3在GSC11細(xì)胞中能與GFAP基因啟動子相應(yīng)區(qū)域結(jié)合。
　　4、在成功構(gòu)建正常與突變的GFAP啟動子報告基因質(zhì)粒后，通過Luciferase Assay檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PAX3后正常GFAP啟動子報告基因熒光素酶活性較對照組明顯提高。P1位

12、點突變的GFAP啟動子報告基因熒光素酶活性明顯下降，而P2位點突變的GFAP啟動子報告基因熒光素酶活性無明顯下降。轉(zhuǎn)錄因子PAX3對GFAP基因啟動子具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，且P1為其轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點。
　　5、EMSA實驗進一步證實了轉(zhuǎn)錄因子PAX3能與GFAP基因啟動子結(jié)合位點P1特異性結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子PAX3表達(dá)與GFAP表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子PAX3通過與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的GFAP基因啟動子區(qū)