乳腺癌干細(xì)胞生物學(xué)特性及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、越來越多的證據(jù)表明，腫瘤是一種干細(xì)胞疾病。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，從根本上說，是由乳腺癌干細(xì)胞引起的。而且，乳腺癌干細(xì)胞對(duì)化療、放療及內(nèi)分泌治療都存在抵抗性。同時(shí)，腫瘤干細(xì)胞位于特定的微環(huán)境中，其為腫瘤干細(xì)胞的自我更新提供支持作用，這些微環(huán)境為腫瘤干細(xì)胞的治療提供新的思路。目前，對(duì)乳腺癌干細(xì)胞微環(huán)境的認(rèn)識(shí)還很不足。為此，我們觀察乳腺間質(zhì)細(xì)胞中最主要的細(xì)胞成分一成纖維細(xì)胞，對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的調(diào)控作用。乳腺癌干細(xì)胞基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控國(guó)內(nèi)外

2、未見報(bào)道，我們構(gòu)建了乳腺癌干細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 一、乳腺癌干細(xì)胞微球體形成影響因素探討 目的：探討MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞及原代乳腺癌細(xì)胞微球體形成的影響因素，并檢測(cè)其中CD44+CD24-/low的表達(dá)。 方法：將MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞及原代乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行微球體培養(yǎng)。取培養(yǎng)第7天的微球體細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行干細(xì)胞比例分析。 結(jié)果：MCF-7細(xì)胞形成微球體的效率最高(2

3、.1±0.3)％，MDA-MB-231細(xì)胞很少形成微球體，原代乳腺癌細(xì)胞未觀察到微球體形成。但在無B27的干細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中，MCF-7易貼壁生長(zhǎng)。MCF-7單層培養(yǎng)細(xì)胞中CD44+CD24-/low的比例為(2.0±0.1)％，而來源不同狀態(tài)的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行微球體培養(yǎng)，微球體細(xì)胞中CD44+CD24-/low的比例分別為(11.8±0.3)％和(8.2±0.8)％，(p<0.01)。MDA-MB-231及原代乳腺癌細(xì)胞中CD44+C

4、D24-/low的表達(dá)分別為(92.2±3.1)％和(93.8±2.4)％。 結(jié)論：MCF-7細(xì)胞通過微球體培養(yǎng)富集了腫瘤干細(xì)胞，而MDA-MB-231及原代乳腺癌細(xì)胞則不能。MDA-MB-231及原代乳腺癌細(xì)胞中CD44+CD24-/low的表達(dá)與微球體形成不呈正相關(guān)。 二、表阿霉素對(duì)乳腺癌微球體細(xì)胞和單層培養(yǎng)細(xì)胞作用的比較 目的：探討表阿霉素對(duì)乳腺癌微球體細(xì)胞和單層培養(yǎng)細(xì)胞的不同作用。 方法：MCF-

5、7細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行微球體培養(yǎng)，噻唑藍(lán)(thiazolyl blue，MTT)法檢測(cè)表阿霉素對(duì)MCF-7微球體細(xì)胞和單層培養(yǎng)細(xì)胞的抑制率，流式細(xì)胞術(shù)分析表阿霉素作用下，MCF-7微球體細(xì)胞和單層培養(yǎng)細(xì)胞中CD44+CD24-的表達(dá)及細(xì)胞周期變化。 結(jié)果：相同濃度(>100ng/mL)的表阿霉素對(duì)MCF-7微球體細(xì)胞的抑制率明顯低于對(duì)單層培養(yǎng)細(xì)胞的抑制率，(P<0.01)；400ng/μL的表阿霉素作用72 h，MCF-7

6、微球體細(xì)胞的CD44+CD24-/low比例為(22.8±4.8)％，高于單層培養(yǎng)細(xì)胞(3.3±0.8)％，(P<0.01)；MCF-7微球體細(xì)胞含有較高比例的G0/G1期(74.33±3.20)％細(xì)胞，高于MCF-7單層培養(yǎng)細(xì)胞(53.40±3.45)％，(P<0.01)，表阿霉素對(duì)微球體細(xì)胞與單層培養(yǎng)細(xì)胞的G0/G1期影響較小，但顯著影響S期及G2期的比例。 結(jié)論：表阿霉素對(duì)MCF-7微球體細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較低，并可用于富集

7、乳腺癌干細(xì)胞，其對(duì)微球體細(xì)胞G0/G1比例影響較小。 三、乳腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的體內(nèi)外調(diào)控研究 目的：體內(nèi)、體外研究正常乳腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞和乳腺癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的調(diào)控作用。 方法：分離、培養(yǎng)正常乳腺及乳腺癌間質(zhì)細(xì)胞并進(jìn)行免疫組織化學(xué)鑒定。不同成纖維細(xì)胞與MCF-7微球體細(xì)胞共培養(yǎng)并流式細(xì)胞術(shù)分析CD44+CD24-比例。流式分選側(cè)亞群細(xì)胞并與不同成纖維細(xì)胞接種NOD/SCID小鼠。小鼠移

8、植瘤HE病理染色。 結(jié)果：正常間質(zhì)成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)陰性，而腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)陽性。共培養(yǎng)后，腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞上調(diào)微球體細(xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞的比例，[(21.4±1.8)％]Vs[(17.2±2.3)％]，P值小于0.05；正常間質(zhì)成纖維下調(diào)微球體細(xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞的比例，[(8.7±0.9)％]Vs[(17.2±2.3)％]，P值小于0.05?；旌辖臃NSP細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞的小鼠均發(fā)生腫瘤，而混合接種

9、SP細(xì)胞和正常間質(zhì)成纖維細(xì)胞的小鼠僅一只發(fā)生腫瘤。 結(jié)論：腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞，而正常間質(zhì)成纖維細(xì)胞則不是。腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的表達(dá)具有正向調(diào)控作用，而正常間質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的表達(dá)具有抑制作用。腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)SP細(xì)胞的成瘤性具有正向調(diào)節(jié)作用，而正常間質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)SP細(xì)胞的成瘤性具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。 四、乳腺癌干細(xì)胞基因表達(dá)譜及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究 目的：通過基因芯片比較SP及

10、MP細(xì)胞基因表達(dá)的差異，并通過網(wǎng)絡(luò)分析的方法研究這些差異表達(dá)基因的相互作用。 方法：差異表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)分析：差異表達(dá)基因KEGG Pathway分析；差異表達(dá)表因TF分析與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及差異表達(dá)基因相互作用的網(wǎng)絡(luò)獲取與分析。 結(jié)果：SP及MP差異表達(dá)基因在細(xì)胞連接通路中表現(xiàn)得最為明顯，出現(xiàn)頻率高達(dá)64.71％。SP細(xì)胞中CXCR4的基因表達(dá)較MP細(xì)胞上調(diào)2.2倍。差異表達(dá)基因中，129個(gè)相互作用的基因構(gòu)成了兩個(gè)基因調(diào)控子網(wǎng)