RNAi沉默GRP94表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女身心健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在國(guó)內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)，雖然近年來(lái)針對(duì)乳腺癌發(fā)病分子水平的研究比較深入，發(fā)現(xiàn)了多種因子及信號(hào)通路參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，但其發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，針對(duì)乳腺癌相關(guān)分子的研究，仍是當(dāng)前研究的重要課題。
　　葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose regulated protein，GRP94)，是主要貯存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，與HSP90有50％的同源性，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，

2、同時(shí)也是未折疊蛋白反應(yīng)下游關(guān)鍵分子，研究發(fā)現(xiàn)GRP94在結(jié)腸癌，胰腺癌，食管癌，乳腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，且參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，而其相關(guān)機(jī)制的研究是當(dāng)前的熱點(diǎn)之一。本課題在細(xì)胞水平檢測(cè)了GRP94在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)在乳腺癌MCF7細(xì)胞中采用RNAi技術(shù)靶向下調(diào)GRP94表達(dá)，觀察沉默GRP94對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲遷移的影響并探討其可能機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)GRP94與乳腺癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，為尋找新的乳腺癌治療靶點(diǎn)、乳腺

3、癌的預(yù)防與治療提供理論依據(jù)。
　　Wnt/β-catenin信號(hào)通路的眾多成員都參與了乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展過程，研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)在乳腺癌中異?；钴S，且協(xié)同TGFβ信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲遷移等重要過程，本研究通過沉默GRP94表達(dá)，進(jìn)一步探討GRP94與Wnt/β-catenin信號(hào)通路之間的聯(lián)系，進(jìn)而闡釋GRP94在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。
　　方法:
　　1.Real-time PCR、W

4、estern blot分別在mRNA與蛋白水平檢測(cè)GRP94在乳腺上皮細(xì)胞MCF10A、乳腺癌MCF7、MDA-MB-231、BT474及SK-BR-3細(xì)胞株中的表達(dá)。
　　2.采用RNAi靶向沉默技術(shù)，在乳腺癌MCF7細(xì)胞株中沉默GRP94基因表達(dá)，觀察其對(duì)MCF7細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲遷移的影響，并通過Western blot分別檢測(cè)相關(guān)分子的表達(dá)。
　　3.Western blot檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)

5、鍵分子及相關(guān)靶基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.GRP94在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)顯著增高，且在MCF7細(xì)胞中表達(dá)最高(P<0.05)。
　　2.在MCF7細(xì)胞中，沉默GRP94表達(dá)后，細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，細(xì)胞增殖、克隆形成能力受到明顯抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，細(xì)胞侵襲遷移能力減弱，MMP2、MMP9及VEGF表達(dá)降低、E-cadherin表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.沉默GRP94

6、表達(dá)后，LRP6表達(dá)明顯降低，APC和Axin表達(dá)增高，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路被阻斷；細(xì)胞核及細(xì)胞漿中β-catenin表達(dá)明顯減少，β-catenin核轉(zhuǎn)位受到抑制，下游靶基因cyclin D1、c-myc表達(dá)減少。
　　結(jié)論:
　　1.GRP94在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)顯著增高，且MCF7中表達(dá)最高。
　　2.下調(diào)GRP94表達(dá)后，抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　3.下