抑制KLF4表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7惡性表型的影響.pdf

1、在過去20年間全世界乳腺癌發(fā)病率幾乎翻了一番?，F(xiàn)今全世界每年約有120萬婦女發(fā)生乳腺癌,有50萬婦女死于乳腺癌。WHO報(bào)告,在西方發(fā)達(dá)國家,乳腺癌已超越其他腫瘤,成為20-59歲女性的首要死因。中國目前的發(fā)病率雖然不如西方國家高,但在過去30年中,乳腺癌是上升最快的惡性腫瘤之一,僅次于肺癌,嚴(yán)重威脅我國婦女的身心健康!
　　 隨著對(duì)生物學(xué)標(biāo)志物的不斷深入研究,乳腺癌的診斷和個(gè)體化治療水平逐步提高,為其他腫瘤的診治提供了很好的借鑒

2、。ER、PR、HER-2等分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)以及深入的研究與開發(fā),使得現(xiàn)在的乳腺癌治療手段拓展到了內(nèi)分泌治療、分子靶向治療領(lǐng)域,進(jìn)一步尋找更多、更好的分子或基因治療靶標(biāo)則成為了目前非常重要的熱點(diǎn)之一。
　　 轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)是一群能與基因5’端上有特定序列專一性結(jié)合,從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。因而其表達(dá)的變化會(huì)導(dǎo)致目的基因及目的蛋白的表達(dá)失常,并可能對(duì)腫瘤的

3、發(fā)生、生長、侵襲及轉(zhuǎn)移等起作用。
　　 人類Krüppel樣因子4(KLF4)作為新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子,因?yàn)樵谡T導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞生成iPS細(xì)胞中的重要地位而受到重視,它通過激活或抑制其目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控目標(biāo)基因在細(xì)胞和組織中的表達(dá),以及與細(xì)胞時(shí)相相關(guān)的動(dòng)態(tài)性表達(dá),從而調(diào)控眾多細(xì)胞生理活動(dòng),如細(xì)胞生長、增殖、分化及凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)KLF4在原發(fā)性乳腺癌組織中表達(dá)升高,且其核內(nèi)KLF4的高表達(dá)意味著乳腺癌惡性度高,預(yù)后差。使得KLF4

4、在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及治療、判斷預(yù)后等方面的研究逐漸鋪開。
　　 本研究以KLF4為研究對(duì)象,以篩選出的天然高表達(dá)KLF4的人乳腺癌細(xì)胞MCF7為模型,采用人工siRNA(小干擾RNA)轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)KLF4表達(dá)進(jìn)行抑制,初步研究抑制KLF4對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7的生長、克隆形成能力等惡性表型的影響。具體內(nèi)容如下:
　　 1.篩選KLF4高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株:
　　 1.1培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株:MCF7、Bcap37、

5、MDA231、T47D、SK-BR3；并培養(yǎng)天然低表達(dá)KLF4的人肺癌細(xì)胞株H322,及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染KLF4的細(xì)胞株H322／KLF4分別作為陰性和陽性對(duì)照。
　　 1.2檢測(cè)各細(xì)胞株的KLF4在蛋白水平和RNA水平的表達(dá)情況,篩選出在RNA和蛋白水平均天然高表達(dá)KLF4的MCF7細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 2.以KLF4-siRNA敲低MCF7細(xì)胞的KLF4表達(dá):利用Oligofectamine Reagent將KLF4

6、-siRNA轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞MCF7,獲得KLF4敲低的MCF7細(xì)胞；同樣轉(zhuǎn)染control-siRNA至MCF7細(xì)胞。分別提取RNA,以RT-PCR法檢測(cè)KLF4的表達(dá)。
　　 3.以MTT法檢測(cè)KLF4表達(dá)抑制對(duì)MCF7細(xì)胞在體外生長能力的影響:
　　 將KLF4-siRNA轉(zhuǎn)染的MCF7細(xì)胞作為敲低組(MCF7／KLF4-siRNA),control-siRNA轉(zhuǎn)染的MCF7細(xì)胞作為對(duì)照組(MCF7／control

7、-siRNA),分別接種于96孔板,培養(yǎng)1,3,5天,分別加MTT孵育,用DMSO溶解結(jié)晶,在570 nm處讀取吸光度值,繪制生長曲線。結(jié)果顯示,KLF4敲低的細(xì)胞與對(duì)照組相比,生長呈明顯減慢的趨勢(shì),有顯著差異(P<0.01)。
　　 4.克隆形成試驗(yàn)觀察KLF4表達(dá)抑制對(duì)MCF7細(xì)胞克隆形成能力的影響:
　　 將轉(zhuǎn)染好的MCF7／KLF4-siRNA和MCF7／control-siRNA細(xì)胞株分別接種于6孔板,培養(yǎng)14