抑制KLF4表達對乳腺癌細胞MCF7惡性表型的影響.pdf

1、在過去20年間全世界乳腺癌發(fā)病率幾乎翻了一番?，F(xiàn)今全世界每年約有120萬婦女發(fā)生乳腺癌,有50萬婦女死于乳腺癌。WHO報告,在西方發(fā)達國家,乳腺癌已超越其他腫瘤,成為20-59歲女性的首要死因。中國目前的發(fā)病率雖然不如西方國家高,但在過去30年中,乳腺癌是上升最快的惡性腫瘤之一,僅次于肺癌,嚴重威脅我國婦女的身心健康!
　　 隨著對生物學(xué)標志物的不斷深入研究,乳腺癌的診斷和個體化治療水平逐步提高,為其他腫瘤的診治提供了很好的借鑒

2、。ER、PR、HER-2等分子標志物的發(fā)現(xiàn)以及深入的研究與開發(fā),使得現(xiàn)在的乳腺癌治療手段拓展到了內(nèi)分泌治療、分子靶向治療領(lǐng)域,進一步尋找更多、更好的分子或基因治療靶標則成為了目前非常重要的熱點之一。
　　 轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)是一群能與基因5’端上有特定序列專一性結(jié)合,從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質(zhì)分子。因而其表達的變化會導(dǎo)致目的基因及目的蛋白的表達失常,并可能對腫瘤的

3、發(fā)生、生長、侵襲及轉(zhuǎn)移等起作用。
　　 人類Krüppel樣因子4(KLF4)作為新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子,因為在誘導(dǎo)小鼠成纖維細胞生成iPS細胞中的重要地位而受到重視,它通過激活或抑制其目標基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控目標基因在細胞和組織中的表達,以及與細胞時相相關(guān)的動態(tài)性表達,從而調(diào)控眾多細胞生理活動,如細胞生長、增殖、分化及凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)KLF4在原發(fā)性乳腺癌組織中表達升高,且其核內(nèi)KLF4的高表達意味著乳腺癌惡性度高,預(yù)后差。使得KLF4

4、在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及治療、判斷預(yù)后等方面的研究逐漸鋪開。
　　 本研究以KLF4為研究對象,以篩選出的天然高表達KLF4的人乳腺癌細胞MCF7為模型,采用人工siRNA(小干擾RNA)轉(zhuǎn)染技術(shù)對KLF4表達進行抑制,初步研究抑制KLF4對乳腺癌細胞MCF7的生長、克隆形成能力等惡性表型的影響。具體內(nèi)容如下:
　　 1.篩選KLF4高表達的乳腺癌細胞株:
　　 1.1培養(yǎng)人乳腺癌細胞株:MCF7、Bcap37、

5、MDA231、T47D、SK-BR3；并培養(yǎng)天然低表達KLF4的人肺癌細胞株H322,及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染KLF4的細胞株H322／KLF4分別作為陰性和陽性對照。
　　 1.2檢測各細胞株的KLF4在蛋白水平和RNA水平的表達情況,篩選出在RNA和蛋白水平均天然高表達KLF4的MCF7細胞作為后續(xù)實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　 2.以KLF4-siRNA敲低MCF7細胞的KLF4表達:利用Oligofectamine Reagent將KLF4

6、-siRNA轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞MCF7,獲得KLF4敲低的MCF7細胞；同樣轉(zhuǎn)染control-siRNA至MCF7細胞。分別提取RNA,以RT-PCR法檢測KLF4的表達。
　　 3.以MTT法檢測KLF4表達抑制對MCF7細胞在體外生長能力的影響:
　　 將KLF4-siRNA轉(zhuǎn)染的MCF7細胞作為敲低組(MCF7／KLF4-siRNA),control-siRNA轉(zhuǎn)染的MCF7細胞作為對照組(MCF7／control

7、-siRNA),分別接種于96孔板,培養(yǎng)1,3,5天,分別加MTT孵育,用DMSO溶解結(jié)晶,在570 nm處讀取吸光度值,繪制生長曲線。結(jié)果顯示,KLF4敲低的細胞與對照組相比,生長呈明顯減慢的趨勢,有顯著差異(P<0.01)。
　　 4.克隆形成試驗觀察KLF4表達抑制對MCF7細胞克隆形成能力的影響:
　　 將轉(zhuǎn)染好的MCF7／KLF4-siRNA和MCF7／control-siRNA細胞株分別接種于6孔板,培養(yǎng)14