抑制PAR4表達(dá)對(duì)腸癌細(xì)胞SW620惡性表型的影響.pdf

1、惡性腫瘤是迄今嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病之一,侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤兩個(gè)關(guān)鍵的生物學(xué)行為,也是影響腫瘤患者臨床預(yù)后的主要因素,在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移仍然是人類面臨的亟待解決的重大基礎(chǔ)和臨床問(wèn)題。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟多階段的復(fù)雜過(guò)程,受眾多相關(guān)因素的共同影響。在這些相關(guān)因素中,各種蛋白酶在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。以往人們對(duì)蛋白酶的研究主要側(cè)重于其降解細(xì)胞外基質(zhì),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,近年的研究表明,蛋

2、白酶還能通過(guò)激活各種信號(hào)傳導(dǎo)途徑、調(diào)控相應(yīng)的基因表達(dá)而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過(guò)程。
　　 蛋白酶對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控主要是通過(guò)位于細(xì)胞膜表面的蛋白酶激活受體(protease-activated receptors,PARs)進(jìn)行的。PARs是一類帶7個(gè)跨膜區(qū)的自身帶有配體的特殊的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR),其N端經(jīng)特異性蛋白酶水解后成為自身配體而被活化,并通過(guò)與其偶聯(lián)的G蛋白酶

3、觸發(fā)一系列信號(hào)傳導(dǎo),進(jìn)而調(diào)控下游相應(yīng)基因的表達(dá)。目前已明確的PARs有4種,其中PAR4(protease-activated receptor4)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)亞型,是一個(gè)低親和力的凝血酶受體。研究表明,PAR4在乳腺癌、肝癌、腸癌、前列腺癌、軟組織肉瘤、星形細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高,根據(jù)這些情況,可以推測(cè)PAR4表達(dá)水平與這些惡性腫瘤的生物學(xué)行為相關(guān),但PAR4在不同腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高的原因及其與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)

4、移等惡性表型的關(guān)系,目前的研究均未涉及。
　　 本課題以PAR4作為研究對(duì)象,以人腸癌細(xì)胞SW620為模型,采用人工microRNA技術(shù)對(duì)PAR4進(jìn)行表達(dá)抑制,研究抑制PAR4表達(dá)對(duì)腸癌細(xì)胞SW620生長(zhǎng)、移及耐藥等惡性表型的影響。具體內(nèi)容如下:
　　 1.靶向抑制PAR4表達(dá)的人工microRNA表達(dá)載體的構(gòu)建:
　　 1.1根據(jù)NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得人PAR4的mRNA序列的資料(登錄號(hào)NM_00

5、3950),利用網(wǎng)絡(luò)資源(http://cancan.cshl.edu/cgi-bin/Codex/Codex.cgi),選擇合適的人工microRNA序列,通過(guò)兩次PCR擴(kuò)增獲得142 bp的人工microRNA前體片段,克隆至pMD19-T載體上,用BamHⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定,并經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)。
　　 1.2將經(jīng)測(cè)序證實(shí)正確的人工microRNA前體序列進(jìn)行串聯(lián)連接,得到8個(gè)串聯(lián)連接的人工microRNA前體序列后,以

6、BamHⅠ和BglⅡ雙酶切,亞克隆于經(jīng)去磷酸化pcDNA3.1(+)的BamHⅠ位點(diǎn),用BamHⅠ和PvuⅠ酶酶切鑒定轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒,將正向插入片段的表達(dá)載體命名為pcDNA3.1(+)-8×PAR4-ami。
　　 2.PAR4表達(dá)抑制對(duì)SW620細(xì)胞生長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)能力的影響
　　 2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染:
　　 利用LipofectamineTM2000將pcDNA3.1(+)-8×PAR4-ami表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人腸癌細(xì)胞SW6

7、20,G418篩選抗性細(xì)胞克隆,Western Blot檢測(cè)PAR4表達(dá),獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人工microRNA表達(dá)載體的SW620細(xì)胞。同樣轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體至SW620細(xì)胞并篩選G418抗性細(xì)胞克隆,提取基因組DNA,以PCR法鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
　　 2.2 MTT法檢測(cè)PAR4表達(dá)抑制對(duì)SW620細(xì)胞在體外生長(zhǎng)能力的影響:
　　 將人工microRNA表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組(SW620/pcDNA3.1(+)

8、-8×PAR4-ami)空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組(SW620/pcDNA3.1(+))和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(SW620)分別接種于96孔板,培養(yǎng)0～5天,加MTT孵育,用DMSO溶解結(jié)晶,在570 nm處讀取吸光度值,繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染人工microRNA表達(dá)載體的細(xì)胞與兩個(gè)對(duì)照組相比,生長(zhǎng)呈明顯減慢的趨勢(shì),均有顯著差異(P＜0.01)。
　　 2.3軟瓊脂集落形成法檢測(cè)PAR4表達(dá)抑制對(duì)SW620細(xì)胞體外生長(zhǎng)能力的影響:
　

9、　 將上述三組細(xì)胞分別在用RPM11640配制的0.33％軟瓊脂中培養(yǎng)14天后,計(jì)數(shù)各組細(xì)胞形成的多于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù),結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染人工microRNA表達(dá)體的SW620細(xì)胞的軟瓊脂克隆形成數(shù)量與兩個(gè)對(duì)照組相比均有顯著差異(P＜0.01)。
　　 2.4劃痕試驗(yàn)檢測(cè)PAR4表達(dá)抑制對(duì)SW620細(xì)胞體外遷移能力的影響:
　　 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的上述三組細(xì)胞分別接種于六孔板,加絲裂霉素C處理24h后換正常的含10％小牛

10、血清的RPMI1640培養(yǎng)液,用10μl加樣槍頭在六孔板中劃痕,分別培養(yǎng)0、2、4、6天,在倒置顯微鏡下觀察并記錄劃痕邊緣細(xì)胞向空白區(qū)擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)情況。結(jié)果顯示在第0、2天各組細(xì)胞無(wú)明顯差異,第4、6天人工microRNA表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞向劃痕區(qū)擴(kuò)散減慢,與兩個(gè)對(duì)照組相比出現(xiàn)較為明顯的差異。
　　 2.5 Transwell法檢測(cè)PAR4表達(dá)抑制對(duì)SW620細(xì)胞穿膜運(yùn)動(dòng)能力的影響:
　　 將上述三組細(xì)胞分別懸浮于無(wú)血清培

11、養(yǎng)液中接種到置于24孔板的Transwell小室中,外加正常含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)3天后結(jié)晶紫染色,在400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-8×PAR4-ami的細(xì)胞組遷移能力與兩個(gè)對(duì)照組細(xì)胞均有顯著差異(P＜0.01)。
　　 2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PAR4表達(dá)抑制對(duì)SW620細(xì)胞周期的影響:
　　 將上述三組細(xì)胞接種于六孔板培養(yǎng),收集細(xì)胞,PBS洗滌后,用70％乙醇溶液4℃固定過(guò)夜,以PBS洗

12、滌細(xì)胞后,碘化丙啶染色,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示,PAR4表達(dá)抑制可以引起SW620細(xì)胞G2/M期減少。
　　 3.IC50法測(cè)定PAR4表達(dá)抑制對(duì)SW620細(xì)胞藥物敏感性的影響:
　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述三組細(xì)胞,接種96孔板中,加入不同濃度的5-氟尿嘧啶和順鉑,培養(yǎng)3天后用MTT法進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算IC50。結(jié)果顯示,抑制PAR4的表達(dá)可以明顯提高SW620細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶和順鉑的耐藥性(P＜0.01)