乳腺癌干細(xì)胞自吞噬水平及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　 越來(lái)越多的研究證實(shí),血液系統(tǒng)腫瘤和部分實(shí)體瘤中存在著一群成瘤能力特別強(qiáng),分化程度極低的細(xì)胞,稱為“腫瘤干細(xì)胞”(cancer stem cells,CSCc)或“腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞”(tumor-initiating cells,T-ICs)(1-4)。目前的研究證實(shí)乳腺癌中也存在著乳腺癌干細(xì)胞。利用特異性的標(biāo)記物L(fēng)in-ESA+CD44+CD24-/弱陽(yáng)性(5)或ALDH1(6)分選出的人乳腺癌細(xì)胞具有自我更新、多

2、向分化的潛能,數(shù)目極少就能成瘤,類似于正常的干細(xì)胞；鼠來(lái)源的單個(gè)的LA7乳腺癌細(xì)胞能在體外形成具有腺管和腺泡樣結(jié)構(gòu)的腺管樹(shù),并能在NOD-SCID鼠中形成腫瘤(7)；在我們課題組既往的研究中證實(shí),從人乳腺癌細(xì)胞株和原代人乳腺癌細(xì)胞中能分離出具有干細(xì)胞樣特性的乳腺癌細(xì)胞(8)。而且,體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細(xì)胞對(duì)各種治療耐受。化療是治療乳腺癌的重要手段,乳腺癌干細(xì)胞對(duì)阿霉素和順鉑等多種化療藥物耐受,臨床治療過(guò)程中有相當(dāng)部分的患者在化療后甚至

3、化療期間出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,且化療后富集的乳腺癌細(xì)胞特異性高表達(dá)CD44+/CD24-,具有干細(xì)胞樣特性(8)。以上的研究結(jié)果提示很可能是殘存的乳腺癌干細(xì)胞對(duì)化療耐受,盡管消滅了非腫瘤干細(xì)胞導(dǎo)致了疾病的緩解,但是如果沒(méi)有清除腫瘤干細(xì)胞,腫瘤仍舊會(huì)復(fù)發(fā)。因此,腫瘤干細(xì)胞不僅僅是腫瘤的起源,也是腫瘤對(duì)治療耐受,繼而出現(xiàn)疾病進(jìn)展(3)、復(fù)發(fā)(9)、轉(zhuǎn)移(3)的重要因?yàn)椤?br>　　 多種人類腫瘤存在自噬活性的改變。通常所說(shuō)的自噬(auto

4、phagy),是指巨自噬(Macroautophagy),是高等和低等動(dòng)物中均存在的高度保守的溶酶體分解代謝細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器的過(guò)程。自噬在不同腫瘤或同一腫瘤的不同階段發(fā)揮不同的作用。因此,autophagy對(duì)細(xì)胞的作用具有兩面性,可以說(shuō)是一把雙刃劍,既可以作為細(xì)胞生長(zhǎng)的“朋友”,也可能成為“敵人”(10-12)。迄今為止,自吞噬在腫瘤干細(xì)胞研究領(lǐng)域中的作用仍舊是空白,自吞噬作用是促進(jìn)了還是抑制了乳腺癌干細(xì)胞的生存不清楚。對(duì)腫瘤干細(xì)胞自

5、噬特性的研究,對(duì)深入理解腫瘤干細(xì)胞乃至整個(gè)腫瘤的生物學(xué)特性具有極其重要的意義,將有助于更加清晰的理解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,為乳腺癌的治療提供新的靶標(biāo)和新的思路。
　　 研究目的:
　　 1.利用CellSearchTM System自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化定量檢測(cè)、純化和富集乳腺癌患者外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs),從功能和分子標(biāo)記物方面證明CTCs具有腫瘤干細(xì)胞樣的特性,建立新型

6、的體內(nèi)外富集乳腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)模型。
　　 2.乳腺癌干細(xì)胞的自吞噬水平。
　　 3.乳腺癌干細(xì)胞自吞噬作用的調(diào)控機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 圍繞上述研究目的,本研究采用以下方法:利用CellSearchTM System富集人乳腺癌患者外周血中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞(CTCs),利用懸浮培養(yǎng)體系富集原代和細(xì)胞株來(lái)源的球囊細(xì)胞,通過(guò)體內(nèi)外研究,從生物學(xué)功能和分子標(biāo)記物方面證明CTCs和球囊細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞

7、樣的特性。
　　 將具有腫瘤干細(xì)胞樣特性的CTCs和球囊細(xì)胞置于無(wú)血清、無(wú)氨基酸的培養(yǎng)基(EBSS)中,建立饑餓模型誘導(dǎo)自噬(autophagy),并同時(shí)應(yīng)用溶酶體抑制劑Bafilomycin Al(Baf-Al)阻斷自噬體(autophagsome)與溶酶體(lysome)的融合,阻斷自噬發(fā)生過(guò)程(autophagic flux),通過(guò)免疫蛋白印記技術(shù)(western-blot)檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞(失巢生長(zhǎng)的CTCs和球囊細(xì)胞)

8、與非乳腺癌干細(xì)胞(在巢生長(zhǎng)的原代腫瘤細(xì)胞和貼壁細(xì)胞)中LC3-Ⅱ的蛋白水平表達(dá)變化,利用免疫熒光技術(shù),結(jié)合共聚焦顯微鏡技術(shù)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染了GFP-LC3融合蛋白的MCF7球囊細(xì)胞和貼壁細(xì)胞中的LC3 dots(autophagysome),比較乳腺癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞的基礎(chǔ)自吞噬水平以及饑餓條件下的自吞噬水平的變化。
　　 利用real—time PCR,western-blot檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞參與調(diào)控autophagy的相關(guān)信號(hào)通路

9、:Beclinl/PI3K classⅢ和mTOR依賴的信號(hào)通路的激活情況。利用PI3K的抑制劑wortminne和3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制PI3K ClassⅢ的活性,觀察饑餓條件下LC3-Ⅱ的表達(dá)變化。應(yīng)用Beclinl turn on-off質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞(MCF7/Beclinl),western-blot確認(rèn)Tetracyclin處理后,MCF7/Beclinl細(xì)胞Beclinl的表

10、達(dá)關(guān)閉,再進(jìn)一步觀察關(guān)閉Beclinl表達(dá)后MCF7球囊細(xì)胞在饑餓條件下自吞噬水平的變化。利用Rapamycin阻斷mTOR通路的激活,觀察MCF7球囊細(xì)胞在饑餓條件下自吞噬水平的變化。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.CellSearchTM System能富集高純度人乳腺癌外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞(CTCs,),CTCs高表達(dá)CD44+/CD24-和ALDH1+,并具有自我更新功能。
　　 2.原代來(lái)源和細(xì)胞株來(lái)源的

11、球囊細(xì)胞具有自我更新能力,高表達(dá)CD44+/CD24-和ALDH1+,強(qiáng)大的體內(nèi)成瘤能力,具有乳腺癌干細(xì)胞樣特性。
　　 3.與非乳腺癌干細(xì)胞相比,乳腺癌干細(xì)胞具有更高的基礎(chǔ)自噬水平。
　　 4.饑餓狀態(tài)下,乳腺癌干細(xì)胞具有更高的自噬水平。
　　 5.Beclinl/PI3K classⅢ和mTOR信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)了乳腺癌干細(xì)胞的自噬水平。Beclinl/PI3K ClassⅢ在乳腺癌干細(xì)胞早期自吞噬的誘導(dǎo)中發(fā)揮