乳腺癌干細胞自吞噬水平及其調(diào)控機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　 越來越多的研究證實,血液系統(tǒng)腫瘤和部分實體瘤中存在著一群成瘤能力特別強,分化程度極低的細胞,稱為“腫瘤干細胞”(cancer stem cells,CSCc)或“腫瘤啟動細胞”(tumor-initiating cells,T-ICs)(1-4)。目前的研究證實乳腺癌中也存在著乳腺癌干細胞。利用特異性的標記物Lin-ESA+CD44+CD24-/弱陽性(5)或ALDH1(6)分選出的人乳腺癌細胞具有自我更新、多

2、向分化的潛能,數(shù)目極少就能成瘤,類似于正常的干細胞；鼠來源的單個的LA7乳腺癌細胞能在體外形成具有腺管和腺泡樣結(jié)構(gòu)的腺管樹,并能在NOD-SCID鼠中形成腫瘤(7)；在我們課題組既往的研究中證實,從人乳腺癌細胞株和原代人乳腺癌細胞中能分離出具有干細胞樣特性的乳腺癌細胞(8)。而且,體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細胞對各種治療耐受?；熓侵委熑橄侔┑闹匾侄?乳腺癌干細胞對阿霉素和順鉑等多種化療藥物耐受,臨床治療過程中有相當部分的患者在化療后甚至

3、化療期間出現(xiàn)腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移,且化療后富集的乳腺癌細胞特異性高表達CD44+/CD24-,具有干細胞樣特性(8)。以上的研究結(jié)果提示很可能是殘存的乳腺癌干細胞對化療耐受,盡管消滅了非腫瘤干細胞導致了疾病的緩解,但是如果沒有清除腫瘤干細胞,腫瘤仍舊會復發(fā)。因此,腫瘤干細胞不僅僅是腫瘤的起源,也是腫瘤對治療耐受,繼而出現(xiàn)疾病進展(3)、復發(fā)(9)、轉(zhuǎn)移(3)的重要因為。
　　 多種人類腫瘤存在自噬活性的改變。通常所說的自噬(auto

4、phagy),是指巨自噬(Macroautophagy),是高等和低等動物中均存在的高度保守的溶酶體分解代謝細胞內(nèi)蛋白和細胞器的過程。自噬在不同腫瘤或同一腫瘤的不同階段發(fā)揮不同的作用。因此,autophagy對細胞的作用具有兩面性,可以說是一把雙刃劍,既可以作為細胞生長的“朋友”,也可能成為“敵人”(10-12)。迄今為止,自吞噬在腫瘤干細胞研究領(lǐng)域中的作用仍舊是空白,自吞噬作用是促進了還是抑制了乳腺癌干細胞的生存不清楚。對腫瘤干細胞自

5、噬特性的研究,對深入理解腫瘤干細胞乃至整個腫瘤的生物學特性具有極其重要的意義,將有助于更加清晰的理解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制,為乳腺癌的治療提供新的靶標和新的思路。
　　 研究目的:
　　 1.利用CellSearchTM System自動化、標準化定量檢測、純化和富集乳腺癌患者外周血循環(huán)的腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs),從功能和分子標記物方面證明CTCs具有腫瘤干細胞樣的特性,建立新型

6、的體內(nèi)外富集乳腺癌干細胞的生物學模型。
　　 2.乳腺癌干細胞的自吞噬水平。
　　 3.乳腺癌干細胞自吞噬作用的調(diào)控機制。
　　 研究方法:
　　 圍繞上述研究目的,本研究采用以下方法:利用CellSearchTM System富集人乳腺癌患者外周血中循環(huán)的腫瘤細胞(CTCs),利用懸浮培養(yǎng)體系富集原代和細胞株來源的球囊細胞,通過體內(nèi)外研究,從生物學功能和分子標記物方面證明CTCs和球囊細胞具有腫瘤干細胞

7、樣的特性。
　　 將具有腫瘤干細胞樣特性的CTCs和球囊細胞置于無血清、無氨基酸的培養(yǎng)基(EBSS)中,建立饑餓模型誘導自噬(autophagy),并同時應用溶酶體抑制劑Bafilomycin Al(Baf-Al)阻斷自噬體(autophagsome)與溶酶體(lysome)的融合,阻斷自噬發(fā)生過程(autophagic flux),通過免疫蛋白印記技術(shù)(western-blot)檢測乳腺癌干細胞(失巢生長的CTCs和球囊細胞)

8、與非乳腺癌干細胞(在巢生長的原代腫瘤細胞和貼壁細胞)中LC3-Ⅱ的蛋白水平表達變化,利用免疫熒光技術(shù),結(jié)合共聚焦顯微鏡技術(shù)定量檢測轉(zhuǎn)染了GFP-LC3融合蛋白的MCF7球囊細胞和貼壁細胞中的LC3 dots(autophagysome),比較乳腺癌干細胞和非干細胞的基礎(chǔ)自吞噬水平以及饑餓條件下的自吞噬水平的變化。
　　 利用real—time PCR,western-blot檢測腫瘤干細胞參與調(diào)控autophagy的相關(guān)信號通路

9、:Beclinl/PI3K classⅢ和mTOR依賴的信號通路的激活情況。利用PI3K的抑制劑wortminne和3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制PI3K ClassⅢ的活性,觀察饑餓條件下LC3-Ⅱ的表達變化。應用Beclinl turn on-off質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7細胞(MCF7/Beclinl),western-blot確認Tetracyclin處理后,MCF7/Beclinl細胞Beclinl的表

10、達關(guān)閉,再進一步觀察關(guān)閉Beclinl表達后MCF7球囊細胞在饑餓條件下自吞噬水平的變化。利用Rapamycin阻斷mTOR通路的激活,觀察MCF7球囊細胞在饑餓條件下自吞噬水平的變化。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.CellSearchTM System能富集高純度人乳腺癌外周血循環(huán)的腫瘤細胞(CTCs,),CTCs高表達CD44+/CD24-和ALDH1+,并具有自我更新功能。
　　 2.原代來源和細胞株來源的

11、球囊細胞具有自我更新能力,高表達CD44+/CD24-和ALDH1+,強大的體內(nèi)成瘤能力,具有乳腺癌干細胞樣特性。
　　 3.與非乳腺癌干細胞相比,乳腺癌干細胞具有更高的基礎(chǔ)自噬水平。
　　 4.饑餓狀態(tài)下,乳腺癌干細胞具有更高的自噬水平。
　　 5.Beclinl/PI3K classⅢ和mTOR信號通路參與調(diào)節(jié)了乳腺癌干細胞的自噬水平。Beclinl/PI3K ClassⅢ在乳腺癌干細胞早期自吞噬的誘導中發(fā)揮