Genistein對乳腺癌干細胞的影響及機制的研究.pdf

1、研究背景與目的:2013年的最新統(tǒng)計顯示全世界女性每一年死于乳腺癌的人數(shù)大于癌癥總死亡人數(shù)的15％，乳腺癌成為女性最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅全球女性的健康。原發(fā)腫瘤病灶包含一般的腫瘤細胞和腫瘤干細胞，腫瘤干細胞具有干細胞的特性，對手術(shù)，放化療不敏感，常規(guī)的治療方法并不能徹底的將其殺死，進而腫瘤預(yù)后不佳。乳腺癌干細胞是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、放化療抵抗的重要原因。以乳腺癌干細胞尤其是乳腺癌干細胞相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點的乳腺癌治療更為有效和徹底，為

2、臨床徹底治愈乳腺癌提供了新的方法和思路。
　　亞洲和歐美國家的飲食結(jié)構(gòu)不同，飲食中的Genistein是導(dǎo)致亞洲，尤其是東南亞地區(qū)居民的乳腺癌發(fā)病率相對于其他地區(qū)明顯較低的關(guān)鍵。Genistein是大豆類植物中天然存在的異黃酮類物質(zhì)，可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用于癌細胞。而這些信號傳導(dǎo)通路同時在乳腺癌干細胞的信號調(diào)控中起到重要作用。特別是近期關(guān)于Hedgehog(Hh)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，提示其異?；罨谌橄侔┑陌l(fā)生發(fā)展中起到重要作

3、用。
　　本實驗?zāi)康氖翘接慓enistein對乳腺癌干細胞的作用及其機制，為治療乳腺癌提供重要的理論和實驗依據(jù)，具有重要的臨床和病理意義。
　　方法:本研究以乳腺癌細胞系MCF-7和裸鼠乳腺癌移植瘤模型作為主要研究對象。采用CCK-8實驗測定24小時IC50的Genistein的劑量。分別通過集落形成實驗和AV-PI流式細胞分析驗證Genistein對乳腺癌細胞的增殖和凋亡的影響。其次進一步通過成球試驗定性分析和流式細胞技術(shù)

4、檢測乳腺癌干細胞表面標記物CD44+CD24-相對定量分析，并且用Western Blot進一步驗證乳腺癌干細胞另一重要標記物ALDH1的表達，探討Genistein對乳腺癌干細胞的作用。
　　裸鼠乳腺癌模型來驗證上述體外試驗得到的結(jié)論。通過比較形成腫瘤的大小，免疫組化檢測乳腺癌干細胞標記物ALDH1的表達，驗證Genistein小鼠體內(nèi)試驗和體外試驗結(jié)果。
　　最后蛋白水平應(yīng)用Western Blot，基因水平應(yīng)用real

5、-time PCR檢測Genistein對實驗組的Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異性蛋白和基因的影響。
　　結(jié)果:
　　1.CCK-8法檢測Genistein對乳腺癌細胞增殖的影響結(jié)果提示:低濃度劑量時Genistein對其抑制作用很弱;較高濃度時抑制作用明顯增強。24h其IC50為32.5μg/ml。集落形成試驗5μg/ml Genistein的細胞存活分數(shù)為81％，10μg/ml即可觀察到明顯的集落數(shù)目的降低;15μg

6、/ml Genistein作用于乳腺癌細胞，基本不形成集落。流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡，在0、15、30μg/ml Genistein三個實驗組早期凋亡率分別為1.50％、18.38％、29.45％。
　　2.乳腺球形成試驗結(jié)果顯示Genistein實驗組乳腺球的體積明顯低于對照組，數(shù)目減少。并且實驗組細胞有出現(xiàn)凋亡和壞死。流式細胞儀檢測CD44+CD24-細胞的比例:對照組CD44+CD24細胞占總細胞的比例為1.79％。15μg

7、/ml、30μg/mlGenistein實驗組CD44+CD24-細胞占總細胞的比例分別為0.93％、0.88％。Western blot檢測Genistein實驗組ALDH1的表達低于對照組。0、5、10μg/ml Genistein的ALDH1蛋白的表達分別為1.57±0.21、1.02±0.37、0.71±0.43。
　　3.小鼠腫瘤稱重，自第一次給藥第21天后，0、5、10μg/ml Genistein作用的腫瘤重量分別為

8、2.21±0.72、1.38±0.65、0.84±0.47g。免疫組織化學(xué)檢測不同濃度Genistein作用小鼠腫瘤后ALDH1的表達，結(jié)果顯示實驗組ALDH1的表達明顯下降。
　　4.Western Blot和real-time PCR分別檢測蛋白水平和基因水平的Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子SHH、PTCH1、SMO、GLI1的表達。結(jié)果實驗組在蛋白水平和基因水平的表達均顯著低于對照組。
　　結(jié)論:
　　1.