調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞特征及EMT的影響與調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　腫瘤微環(huán)境對(duì)于腫瘤細(xì)胞特別是腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)的調(diào)控，在腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療中發(fā)揮重要作用，因此探討腫瘤微環(huán)境對(duì)CSCs的調(diào)控作用及機(jī)制，對(duì)于改善腫瘤患者預(yù)后具有重要意義。腫瘤微環(huán)境中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)，被認(rèn)為是腫瘤免疫抑制的主要機(jī)制之一，但其對(duì)CSCs的影響目前尚未見報(bào)道。本研究主要探討Tregs對(duì)于乳腺癌CS

2、Cs數(shù)量及功能的影響;在此基礎(chǔ)上驗(yàn)證TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是否是Tregs調(diào)控CSCs的主要機(jī)制。
　　方法:
　　1.收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院浸潤性乳腺癌根治術(shù)后石蠟組織標(biāo)本104例，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)標(biāo)本中Foxp3陽性Tregs和ALDH1陽性細(xì)胞的數(shù)量，分析其與乳腺癌臨床病理特征之間的聯(lián)系以及兩者之間的相關(guān)性。
　　2.免

3、疫磁珠法分離乳腺癌患者外周血中CD4+CD25+ Tregs，與乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和BT474共孵育。從基因和蛋白水平檢測(cè)了MCF-7及BT474細(xì)胞與Tregs共孵育前后腫瘤細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物及轉(zhuǎn)錄因子分子表達(dá)水平的變化。并用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、real-time PCR和western blot分別檢測(cè)了BT474細(xì)胞中ALDEFLUOR+細(xì)胞比例以及ALDH

4、1基因和蛋白表達(dá)的改變。利用體外乳腺癌CSCs微球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和微球連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Tregs對(duì)BT474細(xì)胞中CSCs樣細(xì)胞數(shù)量和自我更新能力的影響。并利用5周齡雌性BALB/c裸鼠建立異種移植瘤模型，評(píng)價(jià)Tregs對(duì)乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　3.利用TGF-β1中和抗體、TGF-β1受體小分子阻滯劑SB431542阻斷TGF-β1通道評(píng)價(jià)TGF-β1在Tregs調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT和干性特征中的作用。建立腫瘤細(xì)胞與Tr

5、egs的隔離培養(yǎng)體系和腫瘤細(xì)胞與Tregs上清共培養(yǎng)體系來探討Tregs發(fā)揮作用的方式。
　　結(jié)果:
　　1.38.5％的乳腺癌標(biāo)本可見ALDH1蛋白的表達(dá)，在低分化腫瘤(P=0.019)、雌激素受體陰性(P=0.028)、孕激素受體陰性(P=0.046)及三陰性(P=0.008)乳腺癌患者中含有較多的ALDH1+細(xì)胞。Foxp3+Tregs在分化程度較低(P=0.001)和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P=0.025)中數(shù)量較多。Fo

6、xp3+Tregs和ALDH1+ CSCs樣細(xì)胞之間存在正相關(guān)性（r=0.215，P=0.029）。
　　2.與Tregs共孵育后BT474細(xì)胞間質(zhì)性標(biāo)志物N-cadherin和vimentin表達(dá)增高;MCF-7細(xì)胞上皮性標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)性標(biāo)志物N-cadherin和fibronectin表達(dá)增高。共孵育后EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達(dá)以及細(xì)胞遷移和侵襲能力在兩組腫瘤細(xì)胞中都明顯上調(diào)。相比對(duì)照組，共孵育

7、組BT474細(xì)胞中ALDEFLUOR+ CSCs樣細(xì)胞比例，體外微球形成能力、自我更新能力以及小鼠體內(nèi)致瘤能力增強(qiáng)。
　　3.阻斷TGF-β通路可以阻斷Tregs誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT和干性增加。共孵育組上清中TGF-β1濃度稍高于對(duì)照組(P=0.047)。免疫熒光顯示Tregs表面可見TGF-β1表達(dá)。BT474細(xì)胞中ALDEFLUOR+細(xì)胞比例在對(duì)照組、共孵育組、隔離培養(yǎng)組和Tregs上清培養(yǎng)組分別為45.2％、73.4％、5

8、0.1％和50.6％。
　　結(jié)論:
　　1.人乳腺癌組織中存在Foxp3+Tregs與ALDH1+ CSCs樣細(xì)胞，兩者之間存在正相關(guān)性。
　　2.CD4+CD25+ Tregs可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，并增強(qiáng)細(xì)胞體外遷移和侵襲能力，同時(shí)提高乳腺癌細(xì)胞干性特征。
　　3.CD4+CD25+ Tregs通過TGF-β途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT和干性增加，并且主要通過其表面膜結(jié)合型TGF-β1以直接接觸的方式發(fā)揮作