Leptin誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞PKM2上調(diào)及對(duì)EMT影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討瘦素（Leptin）促人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SK-BR-3的M2型丙酮酸激酶（M2-pyruvate kinase，PKM2）表達(dá)及其誘導(dǎo)上皮間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用及機(jī)制，初步闡明Leptin通過(guò)上調(diào)糖代謝關(guān)鍵酶PKM2而影響乳腺癌EMT及其作用機(jī)制。
　　方法：⑴采用蛋白質(zhì)印記法（ western blotting, WB）和免疫熒光法（ immun

2、ofluorescence, IF）檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468中Leptin長(zhǎng)受體OB-Rb、短受體OB-Rt的表達(dá)；采用人源Leptin處理三株細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化；WB檢測(cè)細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)。⑵Leptin處理人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SK-BR-3后，采用QRT-PCR和WB，分析PKM2mRNA及蛋白水平的變化。⑶采用化學(xué)合成的PKM2-siRNA干擾乳腺癌細(xì)胞 MCF-7、SK

3、-BR-3的PKM2，劃痕及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)Leptin對(duì)兩株細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響；WB檢測(cè)Leptin對(duì)兩株細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響。⑷采用Leptin聯(lián)合PI3K/AKT、JAK/STAT、MAPK/ERK1/2信號(hào)通路抑制劑處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7和SK-BR-3，WB檢測(cè)PKM2的表達(dá)。采用Leptin受體中和抗體處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7和SK-BR-3后， WB檢測(cè)Leptin對(duì)PKM2表達(dá)及對(duì)P

4、I3K/AKT信號(hào)通路激活的影響；采用 WB檢測(cè) PI3K/AKT通路抑制劑處理后，乳腺癌細(xì)胞 MCF-7和SK-BR-3中 PKM2及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。⑸構(gòu)建穩(wěn)定干擾PKM2的乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞株，利用該細(xì)胞株建立裸鼠移植瘤模型，測(cè)量腫瘤大小，觀察裸鼠生存期。免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)腫瘤組織EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，HE染色檢測(cè)腫瘤肝肺轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)果：①WB及IF結(jié)果表明，乳

5、腺癌細(xì)胞 MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-468均表達(dá)OB-Rb和OB-Rt；Leptin能引起三株細(xì)胞形態(tài)發(fā)生EMT樣改變，且下調(diào)上皮性標(biāo)志物E-cadherin，上調(diào)間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin和Fibronectin的表達(dá)。②QRT-PCR及WB結(jié)果顯示，Leptin能顯著上調(diào)MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞PKM2的mRNA及蛋白水平。③為進(jìn)一步探討PKM2在Leptin促乳腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用，采用PKM2-si

6、RNA干擾細(xì)胞表達(dá)PKM2，劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞的遷移和侵襲能力被抑制；WB檢測(cè)提示，細(xì)胞的E-cadherin水平升高，Vimentin、Fibronectin水平降低，即干擾細(xì)胞PKM2表達(dá)后Leptin促EMT作用被抑制。④WB結(jié)果表明，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路能減弱Leptin促PKM2表達(dá)的作用。采用中和性抗體封閉Leptin受體OBR，PI3K/AKT信號(hào)通路的激活被抑制，

7、Leptin促 PKM2表達(dá)的作用也被抑制。采用 WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制后，Leptin促乳腺癌細(xì)胞PKM2表達(dá)及EMT的作用被抑制。⑤裸鼠乳腺癌移植瘤模型分為 SKBR-3、SKBR-3-LV和SKBR-3-shPKM2組，其中 SKBR-3、SKBR-3-LV為對(duì)照組， SKBR-3-shPKM2為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SKBR-3-shPKM2組腫瘤體積、重量均明顯小于對(duì)照組。HE染色SKBR-3、SKBR-3-L

8、V組肝肺轉(zhuǎn)移灶較SKBR-3-shPKM2組明顯增多。瘤組織IHC結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SKBR-3-shPKM2組 E-cadherin表達(dá)明顯升高，Vimentin、Fibronectin表達(dá)明顯降低，SKBR-3-shPKM2組小鼠生存期明顯延長(zhǎng)。
　　結(jié)論：⑴Leptin促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468發(fā)生EMT。⑵Leptin激活 PI3K/AKT信號(hào)通路上調(diào)乳腺癌細(xì)胞 MCF-7、SK-