乏氧對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及與Notch通路關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分、乏氧對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。 目的：觀察乏氧對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。確定最佳乏氧時(shí)間。初步研究乏氧與Notch通路間的關(guān)系。 方法：取指數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后按4×103個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)貼壁后，放入乏氧箱內(nèi)（37℃，1％O2，5％CO2，94％N2），分別培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、24、48小時(shí)后用MTT法檢

2、測(cè)乏氧對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響；確定增殖表達(dá)最明顯的時(shí)間點(diǎn)。取指數(shù)生長期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后按1.2×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)貼壁后，放入乏氧箱內(nèi)（37℃，1％O2，5％CO2，94％N2）4h后，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，Real-time PCR分析Notch及相關(guān)基因hes1、hey1、cyclinD、CDK2、p21的mRNA表達(dá)量的變化。 結(jié)果：乏氧能明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，其增殖表達(dá)最明顯的時(shí)間是乏氧環(huán)境

3、下培養(yǎng)4小時(shí)。乏氧促細(xì)胞增殖，G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少（P<0.05），CyclinD、CDK2的mRNA表達(dá)水平顯著上升（P<0.05），而p21的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；乏氧環(huán)境下，乳腺癌細(xì)胞Notch1及其下游基因Hey1、Hes1的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P均<0.05）； 結(jié)論：乏氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，很可能是通過Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路來實(shí)現(xiàn)的。 第二部分、siRNA下調(diào)Notch1

4、基因表達(dá)后乏氧對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。 目的：應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)下調(diào)Notch1基因表達(dá)后，觀察乏氧對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，探討乏氧與Notch信號(hào)通路之間的關(guān)系。 方法：取指數(shù)生長期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后按4×103個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24小時(shí)后應(yīng)用Lipofectamine2000將針對(duì)Notch1的siRNA片段轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF7。在干擾72h后，放入乏氧箱（37℃，1％O2，5％C

5、O2，94％N2）孵育4小時(shí)，用MTT法檢測(cè)乏氧對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。同樣取指數(shù)生長期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后按1.2×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24小時(shí)后應(yīng)用同樣方法轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF7。在干擾72h后，放入乏氧箱（37℃，1％O2，5％CO2，94％N2）孵育4小時(shí)，Real-time PCR分析Notch及相關(guān)基因hes1、hey1、cyclinD、CDK2、p21的mRNA表達(dá)量的變化。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)

6、胞周期，Westen blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)改變。 結(jié)果：針對(duì)Notch1基因設(shè)計(jì)的siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7，可有效封閉Notch1基因表達(dá)，明顯抑制乏氧對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖，呈G1期阻滯，相關(guān)下游基因hes1、hey1的mRNA表達(dá)水平明顯下降，周期相關(guān)蛋白CyclinD、CDK2的mRNA含量及蛋白表達(dá)水平明顯降低，而p21基因的mRNA含量及蛋白表達(dá)水平則均升高（P均<0.05）。