雌激素受體β對乳腺癌細(xì)胞耐藥及增殖凋亡作用的研究.pdf

1、[研究背景]
　　迄今為止，乳腺癌仍舊是全世界女性死亡的首要原因之一。流行病學(xué)及實驗研究揭示高雌激素水平與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)。這種關(guān)聯(lián)的一種可能解釋是雌激素通過作用于其受體，調(diào)控下游抑癌原癌基因表達(dá)，促腫瘤發(fā)生發(fā)展。雌激素受體包含兩種亞型，ERα和ERβ。眾所周知，ERα對高雌激素所致的乳腺癌有促進(jìn)作用，而ERβ在乳腺癌中的作用還存在諸多爭議。大部分研究稱ERβ可負(fù)性調(diào)節(jié)ERα，是預(yù)后較好的指標(biāo)。然而，這些報道都局限在對ERα陽性

2、乳腺癌中所表達(dá)的ERβ功能的研究。與此相反，多項調(diào)查發(fā)現(xiàn)在ERα陰性乳腺癌中，ERβ表達(dá)與預(yù)后不良的分子亞型呈正相關(guān)，比如ERβ可促進(jìn)癌細(xì)胞增生，ERβ在基底細(xì)胞樣亞型乳腺癌中的表達(dá)增多等等。
　　我們知道腫瘤的惡行性轉(zhuǎn)化體現(xiàn)在腫瘤的耐藥性增強，增殖速度加快及更容易侵襲和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。多藥耐藥的發(fā)生可降低化療的成功率，增加患者死亡率，逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥是十分重要的研究方向。目前，雌激素受體，尤其是ERβ亞型與乳腺癌多藥耐藥關(guān)系的報

3、道還比較少，機(jī)制尚不明確。細(xì)胞膜耐藥蛋白高表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥的重要原因之一。乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)是耐藥蛋白家族中的一員，它的表達(dá)可介導(dǎo)米托蒽醌，阿霉素，表柔比星，拓?fù)涮婵?，甲氨蝶呤?氟尿嘧啶等多種化療藥物的耐藥。由于BCRP廣泛表達(dá)于多種乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌組織中，它對于乳腺癌多藥耐藥的發(fā)生有極為重要的意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，BCRP基因的啟動子區(qū)含有一個雌激素反應(yīng)元件（ERE），配體-ERα復(fù)合物可與之結(jié)合，激活經(jīng)典的基因組

4、通路，調(diào)節(jié)BCRP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因此，我們十分感興趣是否ERβ對BCRP基因表達(dá)也有調(diào)控作用。鑒于ERβ在ERα陽性及陰性乳腺癌中的作用報道不一致，我們選取不同分子亞型的乳腺癌細(xì)胞系（ERα陽性細(xì)胞系MCF-7以及ERα陰性細(xì)胞系MDA-MB-453和MDA-MB-468）和169例乳腺癌組織標(biāo)本（99例ERα陰性標(biāo)本及70例ERα陽性標(biāo)本），對其中表達(dá)的ERβ在乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）介導(dǎo)的多藥耐藥和腫瘤生長方面的作用進(jìn)行研究。

5、>　　[實驗方法]
　　應(yīng)用雌激素及雌激素拮抗劑(TAM或TOR)處理各組細(xì)胞，RT-PCR和westernblot法檢測各組細(xì)胞BCRP基因轉(zhuǎn)錄翻譯水平的變化。通過米托蒽醌外排實驗，檢測細(xì)胞表達(dá)的BCRP是否具有泵活性。MTT法檢測各組細(xì)胞對化療藥的耐藥活性。此外，通過EMSA及ChIP實驗，證實ERβ調(diào)節(jié)BCRP基因表達(dá)的結(jié)合位點。通過分析PCNA蛋白表達(dá)及EdU方法，檢測ERβ結(jié)合不同配體對癌細(xì)胞增殖所起的作用;通過觀察Ca

6、spase-3活化片段生成及AnnexinV/PI雙染流式觀察ERβ在促細(xì)胞凋亡方面的作用。免疫組化染色分析組織樣本中ERβ與BCRP，增殖指標(biāo)（Ki67和腫瘤大?。┘扒忠u轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　[實驗結(jié)果]
　　99例ERα/PR陰性乳腺癌標(biāo)本的免疫組化示ERβ表達(dá)與BCRP表達(dá)及增殖指標(biāo)Ki67和腫瘤大小呈正相關(guān)。在70例ERα陽性標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)ERβ表達(dá)與ERα高表達(dá)呈正相關(guān)，與BCRP和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。體外細(xì)胞實驗的研究

7、發(fā)現(xiàn)，在ERα陰性的乳腺癌細(xì)胞系中（MDA-MB-453和MDA-MB-468），生理濃度雌激素作用下，ERβ表達(dá)促進(jìn)BCRP的生成，米托蒽醌外排顯示生成的BCRP具泵活性，導(dǎo)致BCRP介導(dǎo)的耐藥增強。MTT進(jìn)一步檢測了細(xì)胞在化療藥作用后生存率升高。此外，ERβ表達(dá)導(dǎo)致癌細(xì)胞中PCNA增殖蛋白合成增多，EdU示ERβ高表達(dá)組較干擾組及不表達(dá)組的增殖細(xì)胞比例增多，提示ERβ與雌激素作用后刺激癌細(xì)胞增生。而在ERα陽性細(xì)胞系中(MCF-7)

8、，干擾掉ERα后，細(xì)胞內(nèi)源性ERβ與雌激素作用可下調(diào)BCRP表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)BCRP介導(dǎo)的耐藥。與此同時，westernblot檢測到Caspase-3活化片段出現(xiàn)，AnnexinV/PI雙染顯示早期凋亡細(xì)胞所占比例增多，提示誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步干擾掉ERβ后，上述作用不明顯。
　　在ERα陰性的乳腺癌細(xì)胞系中，雌激素拮抗劑與ERβ作用可逆轉(zhuǎn)雌激素導(dǎo)致的耐藥性增強及癌細(xì)胞增生的情況;而在ERα陽性細(xì)胞系中，雌激素拮抗劑與ERβ結(jié)合

9、卻會誘導(dǎo)耐藥及促癌細(xì)胞增殖。傳統(tǒng)認(rèn)為，雌激素拮抗劑是不能單獨刺激雌激素受體的，我們的結(jié)果卻有不同的發(fā)現(xiàn)。與此同時，應(yīng)用EMSA和ChIP技術(shù)，證實ERβ與其配體復(fù)合物是通過結(jié)合BCRP基因上游啟動子區(qū)的雌激素反應(yīng)元件（ERE），啟動經(jīng)典基因組通路調(diào)節(jié)BCRP的表達(dá)的。
　　[結(jié)論]
　　乳腺癌病人治療中出現(xiàn)的一大障礙，就是化療中發(fā)生的多藥耐藥。多藥耐藥的產(chǎn)生通常與細(xì)胞膜上高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運蛋白密切相關(guān)，這種蛋白具泵功能，可將細(xì)

10、胞內(nèi)的底物藥物泵出，直接減少胞內(nèi)藥物濃度引發(fā)耐藥。BCRP作為ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族中的一員，涉及多種抗癌藥物的自發(fā)性和繼發(fā)性耐藥。其中某些藥物并不是嚴(yán)格意義上BCRP的底物，卻也能發(fā)生交叉耐藥。盡管BCRP在細(xì)胞漿中合成，但它只有轉(zhuǎn)移到胞膜上才有泵功能。因此BCRP在細(xì)胞中的定位直接影響其功能活性。本實驗免疫組化評分，我們僅將胞膜染色的BCRP視為陽性。
　　先前研究發(fā)現(xiàn)激素核受體與BCRP基因表達(dá)相關(guān)。有報道稱，雌激素與ERα結(jié)合

11、可通過一種轉(zhuǎn)錄后機(jī)制下調(diào)BCRP的表達(dá)。Wang等人則發(fā)現(xiàn)，在人胎盤BeWo細(xì)胞中，雌激素可下調(diào)BCRP，但通過ERβ而非ERα。直到BCRP基因啟動子區(qū)的結(jié)構(gòu)特征研究明確后，我們發(fā)現(xiàn)BCRP啟動子區(qū)含有雌激素/孕激素反應(yīng)元件。我們實驗組對此進(jìn)行了大量研究，證實了雌激素-ERα復(fù)合物通過結(jié)合于BCRP啟動子區(qū)的雌激素反應(yīng)元件，上調(diào)BCRP的表達(dá):此外，孕激素-PR復(fù)合物結(jié)合孕激素反應(yīng)元件后，下調(diào)BCRP。然而，ERβ與BCRP的關(guān)系至今

12、仍不明確。僅有兩篇血腦屏障的文獻(xiàn)稱，雌激素與ERβ結(jié)合后，可通過非基因組通路下調(diào)BCRP的表達(dá)。
　　鑒于之前關(guān)于ERβ作用報道的矛盾不統(tǒng)一，我們將在ERα陽性及陰性的不同類型乳腺癌中，探究ERβ的效用。首先，在ERα/PR均陰性的乳腺癌中，免疫組化結(jié)果示有近半數(shù)的病例BCRP膜陽性，提示這些病人可能存在BCRP介導(dǎo)的多藥耐藥。且BCRP陽性與ERβ核陽性呈正相關(guān)。同時，我們發(fā)現(xiàn)ERβ與Ki67及腫瘤大小也呈正相關(guān)，提示ERβ與E

13、Rα/PR均陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。而在ERα陽性乳腺癌中，ERα高表達(dá)伴隨著ERβ表達(dá)，且二者都與BCRP及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。我們知道在細(xì)胞試驗中，雌激素與ERα陽性乳腺癌細(xì)胞作用促進(jìn)細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)移;而臨床病理診斷ERα陽性的乳腺癌細(xì)胞分化程度高，預(yù)后好。這些結(jié)果的矛盾性，是否可用ERβ表達(dá)后負(fù)性調(diào)節(jié)ERα，逆轉(zhuǎn)了ERα的促癌作用來解釋呢？大部分研究都贊同ERβ在ERα陽性乳腺癌中起抑制增殖的作用。此外少數(shù)研究報道在ERα陰性

14、的乳腺癌組織中，ERβ與增殖指標(biāo)正相關(guān)，這些結(jié)果與我們的發(fā)現(xiàn)一致。綜上，免疫組化結(jié)果表明，ERα陰性的乳腺癌組織中，ERβ表達(dá)提示與化療耐藥和腫瘤增殖相關(guān)。ERα陽性乳腺癌中，ERβ與耐藥及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。
　　為了深入了解ERβ作用機(jī)制，我們構(gòu)建了不同的細(xì)胞模型。對ERα/ERβ/PR均陰性的453細(xì)胞，我們外源性過表達(dá)ERβ及BCRP（此BCRP的表達(dá)由含ERE的啟動子啟動P-BCRP）。雌激素(E2)處理后，453/ER

15、β/P-BCRP細(xì)胞的BCRP基因RNA及蛋白水平增高，對照組則無改變。上述結(jié)果證明BCRP的調(diào)控依賴ERβ和雌激素反應(yīng)元件的同時存在。在內(nèi)源性表達(dá)ERβ和BCRP的ERα陰性的468細(xì)胞中，我們再次印證了上述結(jié)論。此外，E2結(jié)合ERβ上調(diào)BCRP的作用可被雌激素拮抗劑三苯氧胺(TAM)抵消。另外，我們還發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性和外源性ERβ在雌激素作用下都可促進(jìn)ERα陰性癌細(xì)胞增生，這些結(jié)果都與免疫組化結(jié)論一致。綜上發(fā)現(xiàn)，抗雌激素治療不僅適用于ER

16、α/PR陽性的乳腺癌，也適用于ERα/PR陰性但ERβ陽性的乳腺癌。因此，檢測ERα/PR陰性乳癌患者ERβ的表達(dá)，對指導(dǎo)內(nèi)分泌治療有一定意義。對于ERα陽性乳腺癌的研究，我們選取了ERα/PR/ERβ陽性的MCF-7細(xì)胞系。由于細(xì)胞中ERβ表達(dá)低于ERα，直接給予雌激素或其拮抗劑，均表現(xiàn)ERα的作用。干擾ERα后，ERβ的作用凸顯。ERβ與雌激素作用后下調(diào)BCRP表達(dá)，效果與ERα相反，也與ERα陰性乳腺癌中ERβ作用相反。并且，我們

17、發(fā)現(xiàn)原本起治療作用的TAM和托瑞米芬(TOR)，與ERα陽性乳癌細(xì)胞中ERβ結(jié)合后，促進(jìn)了BCRP介導(dǎo)的耐藥及癌細(xì)胞增生。另外，我們應(yīng)用EMSA及ChIP在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外證實ERβ對BCRP的調(diào)節(jié)作用是通過結(jié)合雌激素反應(yīng)元件，經(jīng)由經(jīng)典的基因組通路達(dá)成的。
　　綜上所述，我們通過分類研究，發(fā)現(xiàn)ERβ在ERα陽性和陰性乳腺癌中的作用相反。ERβ在ERα陰性乳腺癌中起促腫瘤作用;而在ERα陽性病例中則負(fù)性調(diào)節(jié)ERα，起抑制腫瘤的作用。E