雌激素通過抑制P2Y-,2-受體促進乳腺癌細胞的增殖作用.pdf

1、雌激素在乳腺癌的形成和發(fā)展中起重要作用，外源性雌激素可以增加乳腺癌的患病風險，然而臨床結果顯示，雌激素替代療法在增加乳腺癌患病風險中的作用及其預后的關系尚不明確，因而關于雌激素在乳腺癌發(fā)生，發(fā)展中的作用及生物學機制的研究非常重要。
　　 雌激素是一種脂溶性甾體激素，它可以通過激活細胞核內(nèi)受體(ERα和ERβ)，影響靶基因轉錄和翻譯過程。這種作用牽涉到新蛋白的合成，需要較長的潛伏期，稱為激素的基因組作用(Genomic Actio

2、ns)。另一方面，雌激素可以作用于細胞膜上的結合位點，介導快速效應，稱為激素的非基因組作用(Non-Genomic Actions)。另外也有證據(jù)表明，雌激素激活自身受體后，還可以通過與其它受體發(fā)生交互作用(crosstalk)，影響細胞的增殖和凋亡。
　　 ATP曾被認為僅是一種貯能、供能物質，它還是一種細胞間信息傳遞物質，通過激活P2X(離子通道型受體)和P2Y(G蛋白耦聯(lián)型受體)而產(chǎn)生廣泛的生物學效應。近年來，大量的研究表

3、明P2Y受體存在于各種腫瘤細胞中(乳腺癌、結腸癌、前列腺癌等)，通過激活細胞內(nèi)信號傳導通路，參與腫瘤細胞生長增殖及侵襲轉移的調(diào)控。在已克隆的P2Y受體中，普遍認為P2Y1，P2Y2,P2Y11在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
　　 早在上世紀80年代，就有學者發(fā)現(xiàn)外源性ATP可以抑制腫瘤細胞的生長。乳腺癌細胞自身可以分泌ATP/UTP，乳腺癌細胞中也表達P2Y2受體。該受體活化后可以通過Gq/11激活PLC途徑，最終通過誘導

4、內(nèi)源性Ca2+的釋放在細胞的增殖，分化及凋亡中起重要作用。以上結果說明，ATP受體可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演了重要的角色。但乳腺癌細胞表達的P2Y受體是否參與調(diào)節(jié)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚。
　　 已有的研究發(fā)現(xiàn)，當改變體內(nèi)雌激素水平時，P2X受體的表達會發(fā)生改變，提示雌激素對P2X受體的表達可能存在調(diào)控作用。但迄今為止，雌激素是否影響P2Y受體的表達，以及是否可以通過對ATP受體的調(diào)節(jié)來影響腫瘤細胞的生長分化、增殖凋亡，國

5、內(nèi)外尚未見報道。
　　 因而，本課題以乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231為模型，運用細胞生物學、分子生物學及免疫組織化學等方法，通過體外實驗，探討兩種細胞株中ATP受體的類型，P2Y2對細胞增殖的調(diào)節(jié)作用，以及P2Y2受體參與雌激素對細胞增殖的作用及其中的機制，從而為進一步闡明雌激素對惡性腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展的作用的分子機制提供新的線索；為研制新一代的抗癌藥物提供實驗依據(jù)，將對人類預防和治療腫瘤，降低腫瘤的復發(fā)率起到重要作

6、用。
　　 一、實驗材料和方法
　　 (一)細胞增殖活力的測定
　　 采用MTT法測定細胞增殖活力。種于96孔板上的細胞經(jīng)過加藥處理，每孔加10μl MTT培養(yǎng)3-4h，吸去培養(yǎng)基，每孔加入150μlDMSO，低速振蕩10min。酶標儀490nm波長測各孔吸光度。
　　 (二)免疫熒光細胞化學
　　 種于玻片上的細胞去除培養(yǎng)基，用PBS(0.01M，pH7.4)沖洗三次。4％的多聚甲醛固定10mi

7、n,PBS沖洗三次。分別向不同的玻片上加入用抗體稀釋液稀釋的羊抗人抗體ERα(1∶50)，ERβ(1∶50)，濕盒4℃孵育過夜，PBS沖洗三次，每次10min；加抗體稀釋液稀釋的Cy3標記的驢抗羊IgG抗體(1∶100)37℃孵育1h，PBS沖洗三次，每次10min；熒光顯微鏡觀察記錄。
　　 (三)細胞凋亡率的測定
　　 采用流式細胞術測定細胞凋亡率。種于12孔板中(1×105個/孔)的細胞經(jīng)加藥處理后，PBS清洗一遍

8、，0.25％的胰蛋白酶(含1mM EDTA-4Na)消化后，將細胞吹打重懸于1ml PBS中。800轉/min離心3分鐘，將細胞重懸于100μ1 annexin V結合緩沖液中。按照Alexa Fluor488 annexin V/PI試劑盒的說明書對細胞進行annexin V和PI雙重染色?；靹虮芄忪o置，流式細胞儀測量細胞凋亡。
　　 (四)RNA提取和熒光實時定量PCR測定
　　 1、細胞總RNA提取和cDNA合成<

9、br>　　 種于12孔板中(1×105個/孔)的細胞經(jīng)加藥處理后，以Trizol提取液提取總RNA，采用紫外分光光度法測定RNA樣品純度(OD260/OD280)。同時進行RNA定量。提取的RNA中，每樣本取2μg在25μl體系中反轉錄為cDNA，-20℃保存，用于實時定量聚合酶聯(lián)反應擴增P2Y2受體基因。
　　 2、熒光實時定量PCR
　　 用于擴增P2Y2受體的引物對為TGGCTCGGCGACTGCTAAA(正義)

10、，GCATCTCGGGCAAAGCGTA(反義)。反應條件95℃5min，95℃30sec，62.8℃25秒，72℃30秒，40個循環(huán)。用于擴增β-actin的基因引物為TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG(正義)，GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG(反義)。反應條件95℃5min，95℃30see，58℃25秒，72℃30秒，40個循環(huán)。
　　 (五)蛋白印跡雜交分析(Western Blot)
　　

11、 預冷RIPA緩沖液裂解細胞標本。分光光度法測定蛋白含量，每孔上樣50mg蛋白，經(jīng)10％濃度的SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至硝酸纖維素膜。經(jīng)封閉，洗滌后分別在不同膜上加1∶800稀釋的兔抗人抗體P2Y2(42kD)，1∶800稀釋的鼠抗人抗體β-actin(43kD)，4℃過夜。分別加入1∶1000稀釋耦聯(lián)辣根過氧化物酶的鼠抗兔抗體和羊抗鼠抗體，室溫孵育1h后采用加強化學發(fā)光法(ECL)顯色，暗室曝光、壓片。
　　 二、結

12、論
　　 1.雌激素通過激活ER促進MCF-7細胞的增殖，抑制MCF-7細胞的凋亡，而且雌激素對MCF-7細胞的促增殖作用是通過ERα完成的。
　　 2.UTP通過激活P2Y2受體抑制乳腺癌細胞增殖。
　　 3.雌激素可以通過ERα抑制MCF-7細胞P2Y2受體的表達，進而促進MCF-7細胞的增殖作用。
　　 綜上所述，雌激素可能通過作用于雌激素受體ERα，下調(diào)P2Y2受體的表達，降低P2Y2受體激活對于