人生長(zhǎng)抑素受體2亞型抑制乳腺癌細(xì)胞增殖效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、人生長(zhǎng)抑素受體2亞型（hSSTR2）是生長(zhǎng)抑素受體家族中介導(dǎo)生長(zhǎng)抑素（SS）作用最重要的亞型，通常分布在正常細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞表面。研究表明乳腺癌細(xì)胞膜亦有SSTRs的表達(dá)，但其表達(dá)豐度較低，可能與對(duì)生長(zhǎng)抑素敏感性較差有關(guān)，上調(diào)SSTR2的表達(dá)能否揮抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖有待探索。本研究構(gòu)建了含hSSTR2基因的載體，轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，觀察對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7增殖與凋亡的影響，為以hSSTR2為靶點(diǎn)的乳腺癌治療研究提供新思路。

2、
　　 一、編碼人生長(zhǎng)抑素受體2亞型的真核表達(dá)載體pSIG的構(gòu)建與表達(dá)鑒定
　　 借助PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得hSSTR2全長(zhǎng)基因序列，插入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP/hSSTR2（pSIG）。菌落PCR、酶切鑒定及測(cè)序分析證實(shí)插入的hSSTR2 cDNA閱讀框及連接部位序列正確。Real-time PCR、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）以及免疫熒光技術(shù)確定hSSTR2在MCF-7細(xì)胞中的表

3、達(dá)、定位。在mRNA水平，實(shí)驗(yàn)組hSSTR2的表達(dá)較對(duì)照組提高了2730倍；在蛋白水平，實(shí)驗(yàn)組hSSTR2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分率為49.67±1.35%，空白對(duì)照組及載體對(duì)照組僅為1.63±0.15%、2.33±0.75%。免疫熒光染色證實(shí)hSSTR2在MCF-7細(xì)胞膜上表達(dá)，EGFP表達(dá)于細(xì)胞漿中。
　　 二、hSSTR2抑制乳腺癌細(xì)胞增殖效應(yīng)的研究
　　 在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物，配體與受體的結(jié)合觸發(fā)了一系列生

4、物學(xué)效應(yīng)：
　　 1.對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的影響：碘化丙叮（PI）染色FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組為40.40±14.30%，對(duì)照組僅1.31±0.38%與10.09±6.18%；細(xì)胞周期分析顯示實(shí)驗(yàn)組5.61%的細(xì)胞處于S期，而對(duì)照組分別有22.36%與32.52%的細(xì)胞處于S期，差異有顯著性（P<0.01）。
　　 2.對(duì)MCF-7細(xì)胞EGFR表達(dá)的影響：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞EGFR表達(dá)陽(yáng)性率為64.53±10

5、.05%，對(duì)照組分別為93.01±1.92%與92.14±1.49%，有顯著性差異（P<0.01），提示hSSTR2的高表達(dá)可降低EGFR的表達(dá)。
　　 3.對(duì)EGF抗體刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：加入不同生理濃度的表皮生長(zhǎng)因子（EGF）刺激細(xì)胞，計(jì)算各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(IR%)，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組IR%為0±0%，載體對(duì)照組IR%依次為28.6±7.4%、40.4±6.5%、49.5±11.4%、60.6±14.3%、54.6±10.3

6、%、42.1±9.7%。實(shí)驗(yàn)組IR%依次為70.5±11.1%、70.7±7.0%、81.1±3.6%、88.5±2.7%、86.5±2.5%、79.8±4.9%。在不同EGF濃度刺激下，三組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率有顯著性差異（P<0.01），提示hSSTR2的高表達(dá)可抵抗EGF刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
　　 三、重組腺病毒Ad-SIG的制備及表達(dá)鑒定
　　 將pSIG質(zhì)粒中hSSTR2-IRES-EGFP基因亞克隆至穿梭載體pSh

7、uttle-CMV中，獲得pShuttle-CMV/SIG，經(jīng)PmeⅠ酶切、去磷酸化后轉(zhuǎn)化含pAdEasy-1的超感受態(tài)細(xì)菌BJ5183，細(xì)菌內(nèi)同源重組構(gòu)建腺病毒pAdEasy-1/hSSTR2-IRES-EGFP（Ad-SIG）。將Ad-SIG轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增、純化、滴度測(cè)定。Ad-SIG重組腺病毒感染MCF-7細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡顯示hSSTR2在MCF-7細(xì)胞膜定位表達(dá)，Real-time PCR、