維生素C對(duì)紫杉醇抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的增敏效應(yīng)影響及機(jī)制探討.pdf

1、從最新的流行病學(xué)調(diào)查來看，乳腺癌的發(fā)病率依舊呈逐年上升趨勢(shì)。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，飲食結(jié)構(gòu)也開始偏向西方發(fā)達(dá)國(guó)家，我國(guó)女性雌激素水平的上升，經(jīng)期提前和延長(zhǎng)都使得我國(guó)女性乳腺癌及婦科腫瘤發(fā)病率年年攀升。越來越多的年輕女性被診斷出乳腺癌。有國(guó)外資料顯示，近三年我國(guó)女性的乳腺癌發(fā)病率的中位數(shù)比歐美發(fā)達(dá)國(guó)家早了十年。我國(guó)女性乳腺癌的發(fā)病率已經(jīng)躍居惡性腫瘤第一位。
　　隨著現(xiàn)代診療技術(shù)的不斷提高，乳腺癌的早期診斷越為精確，運(yùn)用不同的治療手

2、法如:放療、化療、手術(shù)、內(nèi)分泌及分子靶向治療使得乳腺癌的總生存率有了顯著的改善。雖然總的生存率得到了改善，但是會(huì)有30％-40％的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前乳腺癌的治療手段仍是以手術(shù)為主的綜合治療，但是僅憑手術(shù)無法改善遠(yuǎn)期生存率。放化療是治療乳腺癌重要的輔助手段，患者通過放化療可以取得一個(gè)較為理想的遠(yuǎn)期生存率，但是放化療之后的副作用往往是患者所不能接受的，許多患者因放化療的毒副反應(yīng)而被迫停止治療而造成乳腺癌的二次復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期的放化療也會(huì)增加

3、乳腺癌細(xì)胞的抵抗作用。因此我們便希望尋找更有效的輔助治療方法來改善乳腺癌的遠(yuǎn)期生存率，同時(shí)該輔助療法降低化療對(duì)乳腺癌患者產(chǎn)生的毒副作用。維生素C(VitC)是臨床上常用的一種輔助藥物，但是在化療時(shí)使用的劑量一般都比較小，根據(jù)國(guó)外一些文獻(xiàn)報(bào)道大劑量的靜脈注射（10g/日）對(duì)于腫瘤治療是有效的。紫杉醇(PTX)是臨床上乳腺癌的常用化療藥之一，是從紅豆杉的樹皮中提取的抗癌有效成分。使用PTX化療會(huì)產(chǎn)生常見的化療毒副反應(yīng)，如:惡心，嘔吐，脫發(fā)，

4、頭暈，頭痛等。這也是化療患者難以堅(jiān)持的主要原因。尋找一種既可以提高化療療效又可以降低化療毒副反應(yīng)的方法就顯得迫在眉睫。
　　目的:
　　本研究以乳腺癌細(xì)胞MCF-7為研究對(duì)象，探討VitC聯(lián)合PTX在體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響，為以后乳腺癌的臨床治療提供新的方法和思路。
　　方法:
　　1.研究材料
　　乳腺癌MCF-7細(xì)胞，VitC注射液，PTX
　　2.研究方法
　　第一部分:體外培

5、養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞，使用MTS法分別檢測(cè)VitC、PTX、VitC聯(lián)合PTX對(duì)MCF-7的增殖抑制率，并計(jì)算出IC50值（抑制一半細(xì)胞增殖的藥物濃度）。計(jì)算腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，使用金氏修正公式來計(jì)算兩種藥物之間是否為協(xié)同關(guān)系。
　　第二部分:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，鋪板，每孔約1×105cells。靜置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中24小時(shí)待同步細(xì)胞周期。根據(jù)AnnexinⅤ-FITC Apoptosis D

6、etection Kit產(chǎn)品試劑盒使用說明書依次加入試劑，最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　第三部:Western Blotting（免疫印跡法）檢測(cè)增殖和凋亡相關(guān)蛋白，培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞系待同步細(xì)胞周期后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同藥物，分別是VitC單藥、PTX單藥、PTX0.625mmol/L分別加VitC高中低三組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按試劑盒說明提取總蛋白，檢測(cè)Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參

7、。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　結(jié)果:
　　第一部分:VitC、PTX、VitC聯(lián)合PTX對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞具有不同程度的抑制作用，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，呈濃度相關(guān)性。低劑量的VitC單藥(＜1.25mmol/L)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞幾乎沒有影響。大劑量的VitC單藥（＞1.25mmol/L）對(duì)MCF-7細(xì)胞的增值抑制率呈濃度相關(guān)。PTX單藥對(duì)MCF-7的增殖呈藥物濃度依賴性。1mm

8、ol/LVitC分別于0.00475μmol/L、0.00237μmol/L、0.00118μmol/L的PTX聯(lián)合用藥增殖抑制率分別為82％、67％、50％。
　　第二部分:正常對(duì)數(shù)期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞與上皮細(xì)胞一樣，顯微鏡下呈上皮樣生長(zhǎng)，細(xì)胞多形性，輪廓清晰，死亡和凋亡細(xì)胞數(shù)量都較少。經(jīng)VitC單藥不同濃度、PTX單藥、VitC不同濃度聯(lián)合PTX固定濃度作用后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組凋亡率，多組間使用單因素方差分析（one

9、-way ANOVA），組間兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)，VitC0.5mmol/L組與對(duì)照組相比較，凋亡率無明顯差別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。PTX組和VitC聯(lián)合PTX組與對(duì)照組相比較，凋亡率有明顯差別，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。VitC聯(lián)合PTX組與PTX組相比較，凋亡率有明顯差別，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第三部分:檢測(cè)Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)。乳腺癌MCF-7細(xì)胞經(jīng)PTX單藥及與

10、不同濃度的VitC聯(lián)合作用，隨著VitC濃度的增加凋亡抑制蛋白Bcl—2的表達(dá)逐漸降低，凋亡促進(jìn)蛋白Caspase-3的表達(dá)逐漸升高。PTX單藥、PTX組+VitC0.5mmol/L組、PTX組+VitC1mmol/L組、PTX組+VitC2mmol/L組與空白對(duì)照組比較蛋白相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.VitC單藥、PTX單藥和VitC聯(lián)合PTX均可以對(duì)MCF-7增殖產(chǎn)生濃度抑制作用，而