MTDH基因轉(zhuǎn)染對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7增殖和紫杉醇敏感性影響的研究.pdf

1、目的：乳腺癌是世界上女性最常見的惡性腫瘤之一，且乳腺癌發(fā)病呈持續(xù)上升趨勢。乳腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和多藥耐藥仍是臨床亟待改善和解決的難題。MTDH原癌基因增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖及抗凋亡能力,促進(jìn)腫瘤新血管生成,并與腫瘤細(xì)胞侵襲、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移及化療耐藥相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究MTDH高表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖及對(duì)紫杉醇耐藥性的影響。
　　方法：
　　1.慢病毒介導(dǎo) MTDH高表達(dá)的 MCF-7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建和鑒定：MTDH基因表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)

2、大腸桿菌轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，提取純化后送測序鑒定。測序成功后使用慢病毒感染MCF-7細(xì)胞，通過綠色熒光蛋白GFP檢測轉(zhuǎn)染效率。使用嘌呤霉素進(jìn)行加壓篩選，獲得穩(wěn)定高表達(dá)MTDH基因的新的乳腺癌細(xì)胞株（命名為 MCF-7-MTDH）和陰性對(duì)照病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞株（命名為MCF-7-vector）。采用RT-PCR方法分別檢測空白對(duì)照組（ MCF-7細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（ MCF-7-vector細(xì)胞）、實(shí)驗(yàn)組（MCF-7-MTDH細(xì)胞）的MTDH

3、 mRNA表達(dá)水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。
　　2.CCK法檢測細(xì)胞增殖及對(duì)紫杉醇的敏感性：以MCF-7作為空白對(duì)照，以MCF-7-vector作為陰性對(duì)照，檢測MTDH高表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖和對(duì)紫杉醇藥物敏感性的影響。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及紫杉醇對(duì)細(xì)胞周期的影響：以 MCF-7作為空白對(duì)照，以MCF-7-vector作為陰性對(duì)照，檢測MTDH高表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響，并檢測紫杉醇藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響。
　　4.統(tǒng)

4、計(jì)分析：每組實(shí)驗(yàn)至少有3個(gè)獨(dú)立樣本的重復(fù)，應(yīng)用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)(t-test)、單因素方差分析（analysis of variance, ANOVA）或非參數(shù)檢驗(yàn)(Nonparametric test)，檢驗(yàn)以P<0.05為差異有顯著性意義。
　　結(jié)果：
　　1.慢病毒介導(dǎo)高表達(dá)MTDH乳腺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建和鑒定
　　MCF-7細(xì)胞MO

5、I值檢測：顯微鏡下觀察慢病毒感染后細(xì)胞綠色熒光蛋白GFP表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳腺癌MCF-7細(xì)胞的MOI（Multiplicity Of Infection，MOI）值為20，即細(xì)胞感染效率達(dá)到80％，且細(xì)胞形態(tài)在感染前后無明顯改變。
　　高表達(dá) MTDH的 MCF-7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建與鑒定：慢病毒感染MCF-7細(xì)胞72h后，通過熒光顯微鏡觀察 MCF-7-MTDH實(shí)驗(yàn)組和MCF-7-vector對(duì)照組均可見綠色熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)

6、染效率都超過80%。經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 MCF-7-MTDH細(xì)胞株和MCF-7-vector細(xì)胞株。通過RT-PCR檢測MCF-7細(xì)胞、MCF-7-vector細(xì)胞、MCF-7-MTDH細(xì)胞中 MTDH基因 mRNA表達(dá)水平分別為1.000±0.100、1.013±0.169、2.093±0.055。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞與MCF-7-vector細(xì)胞MTDH基因mRNA表達(dá)未見明顯差異（P＞0.05）， MCF-

7、7-MTDH細(xì)胞 MTDH基因 mRNA表達(dá)高于 MCF-7細(xì)胞、MCF-7-vector細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.MTDH高表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響
　　將MCF-7、MCF-7-vector、MCF-7-MTDH三種細(xì)胞分別作為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。
　　CCK法檢測各組細(xì)胞于0h、24h、48h、72h的增殖情況，統(tǒng)計(jì)分析顯示空白與陰性對(duì)照兩組細(xì)胞增殖未見明顯差異（ P＞0

8、.05），實(shí)驗(yàn)組MCF-7-MTDH細(xì)胞增殖快于對(duì)照兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　流式細(xì)胞儀檢測各組的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 G0/G1期的比例分別為32.90±1.48%、34.70±1.65%、28.80±1.21%；S期比例分別為43.40±0.95%、40.37±3.61%、57.60±2.10%；G2/M期的比例分別為23.67±0.80%、23.60±2.51%、13.57

9、±2.11%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示空白及陰性對(duì)照組的細(xì)胞周期無顯著差異（P＞0.05），而與對(duì)照對(duì)相比實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞S期延長，G0/G1期和G2/M期縮短（P＜0.05）。
　　3.紫杉醇對(duì)轉(zhuǎn)染前后乳腺癌細(xì)胞增殖和周期的影響
　　將MCF-7、MCF-7-vector、MCF-7-MTDH三種細(xì)胞分別作為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。
　　CCK法檢測1ug/ml紫杉醇作用24h對(duì)三組細(xì)胞的抑制率分別為63.71±0.31%

10、、64.15±0.17%、45.72±0.41%；1ug/ml紫杉醇作用48h對(duì)三組細(xì)胞的抑制率分別為37.46±0.17%、37.10±0.14%、25.90±0.31%；10 ug/ml紫杉醇作用24h對(duì)三組細(xì)胞的抑制率分別為71.11±0.87%、72.55±0.68%、66.97±0.84%；10 ug/ml紫杉醇作用48h對(duì)三組細(xì)胞的抑制率分別為69.95±0.43%、70.77±0.21%、59.95±0.53%，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)

11、果顯示在藥物濃度、作用時(shí)間都相同條件下空白及陰性對(duì)照組的紫杉醇抑制率未見明顯差異（ P＞0.05）。1ug/ml、10ug/ml紫杉醇作用24h和48h后對(duì)實(shí)驗(yàn)組MCF-7-MTDH細(xì)胞的抑制率均低于兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。空白對(duì)照組細(xì)胞10ug/ml紫杉醇作用24h和48h后抑制率未見明顯差異（P＞0.05），其余各組紫杉醇作用48h后抑制率較24h降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　流式細(xì)胞儀檢測

12、紫杉醇用藥后各組的細(xì)胞周期，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：紫杉醇藥物誘導(dǎo)各組細(xì)胞G2/M期比例增高，10ug/ml用藥組較1ug/ml用藥組增高更加明顯（ P＜0.05）；藥物濃度相同的情況下， MCF-7、MCF-7-vector細(xì)胞的 G2/M期比例無顯著差異（ P＞0.05），而MCF-7-MTDH細(xì)胞的G2/M期比例低于MCF-7、MCF-7-vector細(xì)胞，有顯著性差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.通過慢病毒介導(dǎo)成