DNA聚合酶θ對乳腺癌細胞株MCF-7增殖、凋亡和放射敏感性的影響.pdf

1、研究背景：
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國占全身各種惡性腫瘤的7％～8％，僅次于子宮頸癌，近年來有超過子宮頸癌的傾向，并呈逐年上升趨勢，部分大城市報告乳腺癌占女性惡性腫瘤之首位[1]。自19世紀末開始，乳腺癌（改良）根治術(shù)在控制疾病進展、改善患者生存率方面起了不可替代的作用，但其術(shù)后并發(fā)癥多也是人們不可忽視的問題。隨著醫(yī)療設(shè)備、技術(shù)及方法的不斷改進，保乳術(shù)逐步開展。保乳術(shù)與根治術(shù)相比，具有保全患者的生理功能、美容

2、和并發(fā)癥少等優(yōu)點，大大提高了患者的生活質(zhì)量，明顯改善了患者因切除器官導(dǎo)致的心理障礙問題[2]。但其局部復(fù)發(fā)率高，術(shù)后將根據(jù)條件予以放療，從而有效殺滅殘留微小病灶、減少疾病復(fù)發(fā)。全乳放療再追加瘤床的放療劑量是降低疾病復(fù)發(fā)的關(guān)鍵，可顯著提高腫瘤局控率，但可能引起心、肺損傷及上肢水腫等并發(fā)癥[3～5]。如何在提高放療效果的同時減少對正常人體組織的影響成為人們研究乳腺癌輔助治療的一項重要課題。近十年來，人們在腫瘤分子靶向治療方面的研究取得了很大

3、的進展，為改善腫瘤患者的預(yù)后提供了理論基礎(chǔ)。通過干預(yù)腫瘤細胞中存在的分子靶點，可在提高局部放射效果的同時，降低副反應(yīng)的發(fā)生，為乳腺癌患者提高生活質(zhì)量帶來裨益。
　　 DNA聚合酶θ(POLQ)是1990年發(fā)現(xiàn)的人類第八位DNA聚合酶[6]，是DNA聚合酶A家族成員之一，具有DNA雙鏈斷裂(DSB)和DNA鏈間交聯(lián)(interstrandcrosslink，ICL)修復(fù)的重要特性。它參與了DNA損傷耐受[7]，與保持基因完整性密切

4、相關(guān)。缺乏該酶的小鼠網(wǎng)織紅細胞可出現(xiàn)異常核分裂或染色體斷裂的增加[8，9]。部分正常組織細胞或腫瘤細胞內(nèi)缺少該酶時，將導(dǎo)致細胞對過氧化氫[10]、γ射線、爭光霉素[11]等外界因素反應(yīng)敏感，原因是POLQ缺失或突變的細胞染色體穩(wěn)定性差，進而損傷或抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致腫瘤、共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥和奈梅亨染色體不穩(wěn)定綜合征等疾病的發(fā)生[9,12～14]。利用該酶的這一特點，Higgins等通過外源基因，干預(yù)POLQ在宮頸癌He

5、la、喉癌SQ20B和胰腺癌PSN1等細胞株中的表達，證實了沉默POLQ與增加細胞的放射敏感性有著直接的聯(lián)系[15]。增加腫瘤細胞對放射線的敏感性，可以通過較小放射劑量達到同等的放療效果，從而降低了對正常組織的損傷，以及放射線本身可能帶來的二次誘癌幾率。之后該課題組運用回顧性分析方法，發(fā)現(xiàn)大量早期乳腺癌患者切除的腫瘤組織中POLQ過表達，并證實與患者不良臨床預(yù)后、雌激素受體陰性和腫瘤病理學(xué)分級差密切相關(guān)[16]，而后兩者經(jīng)臨床研究證實，

6、均可作為獨立因素導(dǎo)致患者預(yù)后不良[17～19]。干預(yù)POLQ的表達將可能抑制腫瘤細胞的增殖，降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險;避免腫瘤細胞或組織對輔助治療產(chǎn)生耐受，改善患者預(yù)后。
　　 Lemee通過對13個核酸DNA聚合酶基因的研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中高表達而在正常乳腺組織中非高表達的惟一基因是POLQ[20]。這提示干預(yù)POLQ在人體的表達，在可能提高乳腺腫瘤細胞放療敏感性的同時，對正常乳腺組織幾乎不產(chǎn)生影響。乳腺癌細胞對放射線殺傷具有中等敏

7、感度[21]，腫塊局部切除后會給予較高劑量放射治療。在放射線殺死乳腺腫瘤細胞的同時，周圍正常組織亦遭受一定的損傷[22]。所以，提高癌細胞對放療的敏感性，將可使療效大大提高。我們擬用蛋白印跡法(Western blot)明確POLQ在人類乳腺癌細胞株MCF-7中的表達后，利用RNAi技術(shù)，將設(shè)計合理的siRNA轉(zhuǎn)染入人類乳腺癌細胞株MCF-7中，使得POLQ被有效沉默。之后，用不同劑量X射線照射轉(zhuǎn)染前后的MCF-7細胞，觀察POLQ沉默

8、對該細胞株放療敏感性的影響，并進一步探討POLQ沉默后MCF-7乳腺癌細胞株放療敏感性變化的可能機制。
　　 目的:
　　 利用RNAi沉默人類乳腺癌細胞株MCF-7中POLQ蛋白的表達，之后通過體外實驗觀察轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞增殖能力和凋亡率的變化，以及POLQ沉默對該細胞株放射敏感性的影響，為提高乳腺癌細胞對放療的敏感性提供一條新思路。
　　 方法:
　　 1.利用蛋白印跡法檢測人類乳腺癌細胞株MCF

9、-7中POLQ蛋白的表達水平;根據(jù)POLQ基因編碼區(qū)序列，設(shè)計并合成小干擾RNA序列(POLQ-siRNA)，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectarnineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入乳腺癌細胞株MCF-7中;
　　 2.熒光顯微鏡下觀察siRNA對MCF-7細胞株的轉(zhuǎn)染效率:取貼壁良好的MCF-7細胞鋪于24孔板，待細胞生長密度達到60～70％時，用終濃度5、10、20、40、80nmol/L的Control-siRNA-FAM和1.5、2、

10、2.5、3μl/ml的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000交叉配制成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，20min后加入孔內(nèi)，6～12h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率;
　　 3.MCF-7細胞分為實驗組、陰性對照組和空白對照組。利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Westernblot分別從基因和蛋白水平檢測POLQ表達率的變化，明確POLQ-siRNA轉(zhuǎn)染對mRNA和蛋白的抑制效率;
　　 4.利用平板克隆形成實驗檢

11、測轉(zhuǎn)染前后MCF-7細胞克隆形成能力的變化:各組細胞于轉(zhuǎn)染6h后用胰蛋白酶消化，細胞精確計數(shù)，100個/孔接種于六孔板中，每組設(shè)三個平行對照。之后放于5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2周。當每孔內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液。用4％多聚甲醛固定20min，0.1％結(jié)晶紫染色15min。計數(shù)＞50個細胞的克隆，計算克隆形成率(PE);
　　 5.噻唑藍(MTT)比色法檢測轉(zhuǎn)染前后MCF-7細胞增殖能力的變化:MCF-7細胞

12、按4.5×103個/孔鋪于96孔板中，孵育24h后接受轉(zhuǎn)染。分別于轉(zhuǎn)染24、48和72h后加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，繼續(xù)孵育4h后棄去上清液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150μl，搖床上振蕩10min，在酶標儀上讀取490nm波長的吸光度(A)值;
　　 6.平板克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染前后MCF-7細胞對放射的敏感性:MCF-7細胞按不同濃度接種于六孔板中，孵育24h后接受不同劑量X線照射，根據(jù)平板克隆形成實

13、驗結(jié)果運用單擊多靶模型擬合細胞存活曲線，用放射增敏比(SER)作為放射敏感性的量化指標，觀察細胞對放射的敏感性;
　　 7.流式細胞術(shù)檢測不同放射劑量下細胞周期和凋亡率的改變，探討POLQ沉默導(dǎo)致放療增敏的可能機制。
　　 8.統(tǒng)計學(xué)分析:采用GraphPad Prism 4 Demo軟件按單擊多靶模型擬合存活曲線。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，qRT-PCR檢測結(jié)果CT值采用均值（(x)）表示，其余計量資料

14、結(jié)果以均數(shù)±標準差((x)±s)表示，每組實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計符合正態(tài)性分布，結(jié)果顯示方差整齊，3組細胞的蛋白含量[平均吸光度(INT)x雜交信號面積(S)]和平板克隆形成率之間的的比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法，吸光度A值、3組細胞各個細胞周期不同照射劑量點間比較和每組不同照射劑量點間細胞凋亡率的比較采用單因素重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析方法，檢驗水準α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　

15、 1.以宮頸癌Hela細胞株為陽性對照，Western blot實驗證實細胞株MCF-7中POLQ蛋白高表達。該蛋白在體外容易被降解為～170kDa和～100kDa的片段;
　　 2.熒光顯微鏡下顯示，終濃度分別為siRNA40nmol/L和脂質(zhì)體2.5μl/ml時，POLQ-siRNA能有效轉(zhuǎn)染入MCF-7細胞中，細胞計數(shù)法顯示其轉(zhuǎn)染效率在90％以上;
　　 3.qRT-PCR和Westernblot實驗表明，siRN

16、A轉(zhuǎn)染入MCF-7細胞后POLQ-siRNA組細胞POLQmRNA和POLQ蛋白表達量分別是空白對照組的12.158％和(32.013±0.654)％。
　　 4.轉(zhuǎn)染前后MCF-7細胞增殖能力的變化:平板克隆形成實驗結(jié)果顯示siRNA轉(zhuǎn)染入MCF-7細胞后細胞克隆形成率降低;MTT法檢測結(jié)果顯示，實驗組細胞增殖能力低于空白對照組(P=0.000)，陰性對照組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.167）;
　　 5

17、.根據(jù)平板克隆形成實驗結(jié)果計算出不同X線照射劑量下的細胞存活分數(shù)，對存活分數(shù)按照單擊多靶模型進行擬合。放射生物學(xué)參數(shù)顯示，POLQ沉默組MCF-7細胞后D0、Dq值顯著降低，放射增敏比(SER)等于1.24，提示轉(zhuǎn)染POLQ-siRNA后MCF-7細胞對放射的敏感性顯著增強。
　　 6.細胞周期結(jié)果顯示，未照射時POLQ-siRNA組S期細胞比例低于空白對照組(P=0.001);Control-siRNA組與空白對照組比較差異無

18、統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.952)。0、4和8Gy時POLQ-siRNA組G0/G1期細胞均高于空白對照組，Control-siRNA組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著照射劑量的增加，POLQ-siRNA組、Control-siRNA與空白對照組細胞G2/M期比例均提高(P＜0.01)。在不同照射劑量下，POLQ-siRNA組細胞凋亡率均高于空白對照組，Control-siRNA組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。當照射劑量由4Gy增大