靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、凋亡及化療敏感性的影響.pdf

1、本研究擬采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7內(nèi)VEGF-C的表達(dá)，觀察VEGF-C表達(dá)抑制后對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡及化療藥物敏感性的影響，以期為RNA干擾技術(shù)在乳腺癌基因治療中應(yīng)用的可行性提供科學(xué)依據(jù)。 本研究共分三部分內(nèi)容。 第一部分靶向VEGF-C的s i RNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 目的：構(gòu)建靶向人VEGF-C基因的siRNA表達(dá)載體，為下一步研究準(zhǔn)備條件。 方法： 1.設(shè)計(jì)并

2、合成3條互補(bǔ)的編碼VEGF-C shRNA和1條陰性對(duì)照的寡核苷酸序列，退火后與含有U6啟動(dòng)子的pRNAT-U6.1/Neo線性載體質(zhì)粒連接，構(gòu)建形成靶向VEGF-C的重組質(zhì)粒。 2.以重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。用堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定和DNA測序驗(yàn)證。用QIAGEN試劑盒大量制備質(zhì)粒DNA，以備轉(zhuǎn)染用。 結(jié)果： 3個(gè)靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體和1個(gè)陰性對(duì)照載體，經(jīng)PCR產(chǎn)物

3、鑒定和DNA測序證實(shí)插入序列正確無誤，表明目的片段已正確克隆入載體。 結(jié)論： 設(shè)計(jì)合成了3條針對(duì)VEGF-C基因和1條陰性對(duì)照的模板寡核苷酸序列，并插入帶有U6啟動(dòng)子的表達(dá)載體pRNAT-U6.1/Neo，PCR產(chǎn)物和DNA測序證實(shí)靶向VEGF-C基因的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。 第二部分靶向VEGF-C的SiRNA表達(dá)載體對(duì)人乳腺癌細(xì)MCF-7內(nèi)VEGF-C基因表達(dá)的影響 目的：將成功構(gòu)建的靶向VEG

4、F-C的siRNA表達(dá)載體通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細(xì)胞MCF-7內(nèi)，通過RT-PCR、ELISA和免疫細(xì)胞化學(xué)染色等多種方法檢測轉(zhuǎn)染前后乳腺癌細(xì)胞MCF-7內(nèi)VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)的變化，以期為下一步以VEGF-C為靶點(diǎn)的RNA干擾技術(shù)在乳腺癌基因治療中的應(yīng)用提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.將成功構(gòu)建的3個(gè)針對(duì)VEGF-C的siRNA表達(dá)載體pRNAT-VEGF-C-1(簡稱P-1)、pRNAT-VEG

5、F-C-2(簡稱P-2)、pRNAT-VEGF-C-3(簡稱P-3)用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細(xì)胞MCF-7內(nèi)，另設(shè)未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染陰性表達(dá)載體pRNAT-Negative(簡稱P-N)組作為對(duì)照。 2.顯微鏡下觀察siRNA表達(dá)載體內(nèi)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，計(jì)數(shù)綠色熒光細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算綠色熒光細(xì)胞的發(fā)生率，比較各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。 3.RT-PCR、ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測轉(zhuǎn)染前后

6、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7內(nèi)VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1.熒光顯微鏡下觀察MCF-7細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24h后，MCF-7細(xì)胞內(nèi)就出現(xiàn)GFP的大量表達(dá)，以48h表達(dá)最強(qiáng)。約有70％以上的細(xì)胞內(nèi)都有GFP的表達(dá)，各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率之間沒有明顯的差別(P＞0.05)。 2.RT-PCR檢測結(jié)果顯示：VEGF-C與β-actin分別位于610bp和197bp處。P-N轉(zhuǎn)染組VEGF-

7、C mRNA表達(dá)封度較高(98.00％)，在610bp處可見明亮的熒光條帶，與空白對(duì)照組(98.63％)無明顯差異(P＞0.05)。與空白對(duì)照組相比，P-1轉(zhuǎn)染組、P-2轉(zhuǎn)染組、P-3轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的VEGF-C mRNA的表達(dá)均有減弱，其表達(dá)率分別為38.14％、63.42％、68.00％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中P-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)VEGF-C mRNA表達(dá)量最低，干涉效果最明顯。 3.ELISA檢測結(jié)果顯

8、示：P-N轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(385.40±31.42pg/ml)與空白對(duì)照組細(xì)胞(367.12±34.90pg/ml)相比，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C含量無明顯區(qū)別，差異無顯著性(P＞0.05)。而P-1轉(zhuǎn)染組(117.81±24.22pg/ml)、P-2轉(zhuǎn)染組(272.81±29.23pg/ml)、P-3轉(zhuǎn)染組(289.60±31.00pg/ml)與空白對(duì)照組細(xì)胞相比，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C含量均降低，差異有顯著性(P＜0.05)，

9、其中又以P-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液VEGF-C表達(dá)量最低。 4.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，P-N轉(zhuǎn)染組細(xì)胞漿棕黃色染色最深，幾乎與對(duì)照組細(xì)胞漿染色無明顯區(qū)別，而P-1轉(zhuǎn)染組、P-2轉(zhuǎn)染組和P-3轉(zhuǎn)染組細(xì)胞漿呈淺棕黃色，其中又以P-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞漿棕黃色染色表達(dá)最淺。 結(jié)論： 1.LipofectamineTM2000介導(dǎo)靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染效率高，方法

10、簡便等優(yōu)點(diǎn)。 2.RT-PCR、ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法從分子和蛋白水平均證實(shí)：構(gòu)建的3個(gè)針對(duì)VEGF-C的siRNA表達(dá)載體(P-1、P-2、P-3)均可有效抑制MCF-7細(xì)胞內(nèi)VEGF-CmRNA和蛋白的表達(dá)，其中以P-1表達(dá)載體抑制效果最明顯。 第三部分靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、凋亡及化療敏感性的影響 目的：采用MTT法、流式細(xì)胞儀檢測MCF-7細(xì)胞內(nèi)VEGF-C基因表

11、達(dá)抑制后，對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡及對(duì)化療藥物表阿霉素敏感性的變化；采用Western blot檢測RNA干擾技術(shù)與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax表達(dá)比率的影響，以期為靶向VEGF-C的RNA干擾技術(shù)與化療相結(jié)合的聯(lián)合治療在乳腺癌中應(yīng)用的可行性提供依據(jù)。 方法： 1.MTT法檢測MCF-7細(xì)胞的體外耐藥濃度。 2.MTT法檢測轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體的細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用表阿霉

12、素對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響。 3.Annexin V/PI法檢測轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體的細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用表阿霉素對(duì)MCF-7細(xì)胞早期凋亡的影響。 4.Western blot檢測轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體的細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用表阿霉素對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax表達(dá)比率的影響。 結(jié)果： 1.MTT檢測結(jié)果顯示：低濃度的表阿霉素單獨(dú)作用于乳腺癌細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞增殖能力并無明顯的抑制作用。當(dāng)表阿霉素

13、濃度達(dá)到8umol/L以上時(shí)，才顯著抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，并且抑制率隨藥物濃度的增加而上升。 2.MTT檢測結(jié)果顯示：無論加藥組和未加藥組，P-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的存活率都明顯低于P-N轉(zhuǎn)染組和未處理細(xì)胞組，差異具有顯著性(P＜0.05)，而P-N轉(zhuǎn)染組和未處理細(xì)胞組在用藥前后細(xì)胞的存活率之間未見明顯差異(P＞0.05)。當(dāng)加入表阿霉素8umol/L，(該藥物濃度細(xì)胞增殖抑制率小于5％)作用24h后，P-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的存活率明顯下

14、降，由78.63％下降到38.54％，差異有顯著性(P＜0.05)。 3.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：用藥前，P-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為13.10％。加入8umol/L表阿霉素作用24h后，P-1轉(zhuǎn)染組內(nèi)凋亡細(xì)胞增加，凋亡率上升至38.91％，兩者相比差異顯著(P＜0.05)，并且與P-N轉(zhuǎn)染組和未處理細(xì)胞組相比差異顯著(P＜0.05)。P-N轉(zhuǎn)染組和未處理細(xì)胞組用藥前以活細(xì)胞為主，僅有少量凋亡細(xì)胞，加入表阿霉素后細(xì)胞凋亡率略有上升，

15、兩組細(xì)胞凋亡率之間沒有明顯差異(P＞0.05)。 4.Westem blot結(jié)果顯示：未加藥組，P-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組相比下調(diào)(P＜0.05)。藥物處理后，Bcl-2蛋白表達(dá)水平的下調(diào)比靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體單獨(dú)作用時(shí)更明顯(P＜0.05)，而Bax蛋白的表達(dá)水平在用藥前后無明顯改變，從而導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值下降。P-N轉(zhuǎn)染組和未處理細(xì)胞組用藥前后Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平未