線粒體融合素基因-2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及化療敏感性影響的研究.pdf

1、目的：乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年增加，對(duì)乳腺癌的研究已越來(lái)越受到重視。一直以來(lái)細(xì)胞過(guò)度增殖被認(rèn)為是腫瘤的發(fā)病的重要病因，如何抑制腫瘤的過(guò)度增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡是人們研究的熱點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)一種新的大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene，rHSG.現(xiàn)重命名為rmfn2)，該基因能夠抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖。線粒體融合素基因-2(mitofusin-2，mfn2)作為rmfn2

2、的人的同源基因，作用位點(diǎn)位于線粒體的外膜，長(zhǎng)期以來(lái)一直在關(guān)注該基因?qū)€粒體形態(tài)、功能、細(xì)胞呼吸、能量代謝、新陳代謝等方面的影響。線粒體是真核細(xì)胞的一種重要細(xì)胞器，是細(xì)胞能量代謝的場(chǎng)所，對(duì)細(xì)胞的“生”與“死”起著至關(guān)重要的作用。
　　 但該基因在腫瘤方面的研究，很少見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察mfn2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖、凋亡的影響，進(jìn)一步揭示該基因在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的作用和為乳腺癌的治療提供一定

3、的理論基礎(chǔ)。
　　 首先檢測(cè)mfn2在人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)、乳腺癌組織及乳腺組織中的表達(dá)情況，初步判斷該基因是否是一種新的抑癌基因；構(gòu)建包含全長(zhǎng)mfn2基因開(kāi)放閱讀框序列的真核表達(dá)載體；將質(zhì)粒pEGFPmfn2在體外轉(zhuǎn)染MCF-7，觀察外源性mfn2基因?qū)CF-7增殖和凋亡的影響，初步探討其機(jī)制；觀察外源性mfn2基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞的化療敏感性的影響；通過(guò)mfn2基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞株MCF-7在裸鼠成瘤及增殖和轉(zhuǎn)移能力

4、的影響及瘤內(nèi)注射vivo-ietPEITM/pEGFPmfn2復(fù)合物對(duì)裸鼠移植瘤的治療的觀察，為進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)提供前期研究。
　　 方法：應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)mfn2在人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)、乳腺癌組織及乳腺組織中的表達(dá)情況。根據(jù)mfn2基因ORF序列和空載體pEGFP-C2的多克隆位點(diǎn)(MCS)，以正常人骨骼肌cDNA為模板，擴(kuò)增出mfn2基因的ORF序列，并將全長(zhǎng)mfn2基因構(gòu)建進(jìn)pEGFP-C2，然后進(jìn)行篩選和

5、鑒定。將質(zhì)粒pEGFPmfn2在Sofast基因轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下在體外轉(zhuǎn)染MCF-7，將細(xì)胞分成三組：實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pEGFPmfn2組)，空載體對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pEGFP-C2組)，空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)。分別于轉(zhuǎn)染48h后收獲細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞mfn2基因的表達(dá)情況和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功且效率穩(wěn)定后，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法檢測(cè)mfn2對(duì)MCF一7細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)DNA直方圖分析法測(cè)定三組細(xì)胞，檢

6、測(cè)外源性mfn2在體外對(duì)MCF-7細(xì)胞周期分布的影響。用Cyclins/DNA雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的cyclinA。Western blot檢測(cè)三組細(xì)胞的P21waf1、CDK2蛋白的表達(dá)。采用Annnexin-V/P工雙標(biāo)記法檢測(cè)三組細(xì)胞凋亡的變化情況；JC-1標(biāo)記細(xì)胞線粒體，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體跨膜電位(△Ψm)的變化；confocal、電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　 采用Annnexin-V/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)化療藥誘導(dǎo)

7、轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡的變化。分別將三組細(xì)胞異種移植到無(wú)胸腺小鼠體內(nèi)，建立裸鼠人乳腺癌移植瘤模型。成瘤后8周處死動(dòng)物，比較三組裸鼠之間腫瘤的大小和重量。RT-PCR檢測(cè)三組腫瘤組織P21的表達(dá)情況。免疫組化檢測(cè)Ki-67、VEGF的表達(dá)情況。將MCF-7細(xì)胞異種移植到裸鼠體內(nèi)，建立裸鼠人乳腺癌移植瘤模型。成瘤后8周，分別制備兩種vivo-ietPEITM/DNA復(fù)合物：vivo-ietPEITM/pEGFPmfn2、vivo-ietPEITM

8、/pEGFP，一組為陰性對(duì)照，共三組，復(fù)合物多點(diǎn)注射瘤內(nèi)，隔兩天重復(fù)一次，共3次后，48h后處死動(dòng)物。RT-PCR檢測(cè)mfn2基因的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)Ki-67、VEGF的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：mfn2在乳腺癌及乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)明顯低于乳腺組織中的表達(dá)，從人骨骼肌cDNA中PCR擴(kuò)增出的目的基因?yàn)?274bp的特異性的條帶，雙酶切及連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH-5α，長(zhǎng)出大小均勻的菌落。DNA測(cè)序證明：重組質(zhì)粒中目的基因的序列與G

9、eneBank中mfn2基因ORF序列完全一致，進(jìn)一步證實(shí)包含全長(zhǎng)mfn2基因全長(zhǎng)的重組質(zhì)粒pEGFPmfn2構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染pEGFPmfn2組mfn2基因表達(dá)較對(duì)照兩組高。細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pEGFPmfn2組細(xì)胞數(shù)明顯低于未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染pEGFP-C2組(P<0.05)，而對(duì)照兩組細(xì)胞無(wú)明顯差異。轉(zhuǎn)染后48h后用流式細(xì)胞術(shù)DNA直方圖分析法測(cè)定三組細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組48h S期細(xì)胞比例顯著升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=196.

10、7，P<0.05)，兩對(duì)照組相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.33)。用Cyclins/DNA雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染pEGFPmfn2組cyclinA表達(dá)明顯上調(diào)(F=619.2，P<0.05)，兩對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P=0.74)。cyclinA蛋白的表達(dá)水平與S期細(xì)胞所占的比例呈正相關(guān)性，差異有顯著意義(r=0.983，P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與兩對(duì)照組相比在48h表達(dá)p 21明顯增高(

11、F=202.9，P<0.01)，差異有顯著性；磷酸化CDK2低表達(dá)(F=219.0，P<0.01)差異有顯著性。轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組相比明顯促進(jìn)凋亡，轉(zhuǎn)染pEGFPmfn2組15.95％、轉(zhuǎn)染pEGFP-C2組3.58％、空白對(duì)照組4.82％(P<0.05)。轉(zhuǎn)染mfn2cDNA后48h，△Ψm下降。Confocal觀察顯示線粒體緊密地圍繞在核周，電鏡觀察示mfn2使線粒體嵴斷裂、消失、基質(zhì)疏松，腫脹的線粒體圍繞在核周，呈密

12、集排列。在加藥處理后，轉(zhuǎn)染mfn2基因的細(xì)胞凋亡率為69.6％，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組的分別31.0％、23.4％(P<0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤重量、體積明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，兩對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。
　　 實(shí)驗(yàn)組P21的表達(dá)明顯升高與兩對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.05)。與兩對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Ki-67的表達(dá)升高(P<0.05)，而VEGF的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

13、組mfn2基因高表達(dá)(P<0.05)，兩對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。與兩對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Ki-67的表達(dá)升高，而VEGF的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)mfn2基因在乳腺癌組織、乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于正常乳腺組織中的表達(dá)，初步推測(cè)mfn2可能為一種新的抑癌基因。
　　 (2)mfn2的ORF序列正確克隆入載體pEGFP-C2中，mfn2基因真核表達(dá)載體pEGFPmfn2已被構(gòu)建成功。<

14、br>　　 (3)轉(zhuǎn)染外源性mfn2基因可以明顯抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，并使MCF-7細(xì)胞停滯于S期。
　　 (4)轉(zhuǎn)染外源性mfn2基因細(xì)胞cyclinA表達(dá)明顯上調(diào)，cyclinA蛋白的表達(dá)水平與S期細(xì)胞所占的比例呈正相關(guān)，cyclinA的升高可能與S期阻滯，導(dǎo)致cyclinA的蓄積有關(guān)。
　　 (5)轉(zhuǎn)染外源性mfn2基因細(xì)胞p 21的表達(dá)上調(diào)，磷酸化CDK2的表達(dá)下調(diào)。這可能與上調(diào)的p21抑制CDK2，使得細(xì)