慢病毒介導(dǎo)的siRNA干擾乳腺癌MCF-7細(xì)胞MIF因子對(duì)VEGF-C表達(dá)的影響及作用機(jī)制.pdf

1、目的：構(gòu)建具有高轉(zhuǎn)染效率的慢病毒載體，探討慢病毒介導(dǎo)的siRNA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（ macrophage migration inhibitory factor,MIF）的下調(diào)作用并建立穩(wěn)定低表達(dá)MIF因子的乳腺癌細(xì)胞株。研究乳腺癌細(xì)胞中MIF因子的表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C）分泌的影響及作用機(jī)制。
　　方法：⑴構(gòu)建

2、攜帶干擾MIF表達(dá)的siRNA的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞熒光表達(dá)情況及細(xì)胞狀態(tài)。⑵應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（ RT-qPCR)與免疫印記雜交技術(shù)(Western bolt)檢測(cè)siRNA干擾后MCF-7細(xì)胞MIF因子mRNA及蛋白表達(dá)變化。⑶應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)下調(diào)MIF因子后，MCF-7細(xì)胞VEGF-C的mRNA表達(dá)變化及細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF-

3、C分泌情況。⑷應(yīng)用Western blot檢測(cè)MIF因子沉默前后，MAPK信號(hào)通路中p38、P-p38、p44/42、P-p44/42的蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：構(gòu)建的攜帶siRNA的慢病毒載體對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率超過(guò)80％，慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞72小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)量達(dá)到最高水平并趨于穩(wěn)定。所構(gòu)建的慢病毒攜帶的siRNA能有效阻斷乳腺癌MCF-7細(xì)胞中MIF因子mRNA和蛋白的表達(dá)。MIF表達(dá)降低的乳腺癌細(xì)胞中，VEGF