siRNA對MCF-7的VEGF基因表達(dá)的抑制作用.pdf

1、　　目的:用RNA干擾技術(shù)特異性抑制VEGF基因在乳腺癌細(xì)胞MCF-7的表達(dá)。 方法:體外轉(zhuǎn)錄合成針對VEGFmRNA的siRNA，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染后癌細(xì)胞的變化，MTT法檢測細(xì)胞存活率，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后VEGFmRNA表達(dá)水平的變化，ELISA檢測蛋白表達(dá)的下降效果。 結(jié)論:應(yīng)用RNA干擾技術(shù)可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，為腫瘤的基因治療提供了新思路。本文應(yīng)用所設(shè)計的針對VEGF基因的兩組si

2、RNA，轉(zhuǎn)染在體外培養(yǎng)狀態(tài)下的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，結(jié)果顯示無論從細(xì)胞水平、mRNA水平還是蛋白水平，都對VEGF基因的表達(dá)發(fā)揮出明顯的抑制效果。從而得出在細(xì)胞水平上RNAi可成功應(yīng)用于腫瘤的基因治療的結(jié)論，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。同時提示我們在乳腺癌的抗血管生成基因治療中VEGF可以成為有效的靶位點。本文成功應(yīng)用生物軟件所設(shè)計出來的兩個靶位點均能有效抑制VEGF蛋白的分泌、表達(dá)及人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的增殖，為下一步動物試

3、驗打下良好的基礎(chǔ)。驗證了應(yīng)用RNA干擾技術(shù)可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，為腫瘤的基因治療提供了新思路。siRNA能夠成功應(yīng)用于體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系作為基因治療腫瘤的臨床前試驗，極有可能成為未來腫瘤基因治療的生物類新興藥物。實驗所用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒所轉(zhuǎn)錄出來的siRNA純度高，可直接應(yīng)用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染siRNA的效率比較高，可以基本滿足試驗需要。脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到RNA的磷酸骨架上以及

4、帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。帶負(fù)電的RNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成RNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物。轉(zhuǎn)染時避免使用抗生素和血清以提高轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體作為一種載體把siRNA帶入細(xì)胞內(nèi)，其與siRNA有個最佳質(zhì)量比例，統(tǒng)計結(jié)果顯示質(zhì)量比為1：1時效果最佳。文獻(xiàn)報道脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法可以顯著提高細(xì)胞對反義寡核苷酸的攝入，當(dāng)脂質(zhì)體與寡核苷酸的質(zhì)量比(ug/ug)為2：1時轉(zhuǎn)染效率最高。由于我們所用為雙鏈寡核苷酸，其分子量應(yīng)該為反義寡核苷酸的兩倍，故質(zhì)