siRNA對PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白nsplα和nsp11表達(dá)的抑制作用研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS），又稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種持續(xù)或間歇性出現(xiàn)的一種重度疾病。PRRSV的ORF1a，ORF1b分別編碼非結(jié)構(gòu)聚合蛋白pp1a以及pp1ab。隨著基因組mRNA合成以上這兩種蛋白質(zhì)，pp1a和pp1ab被ORF1a編碼的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶(PCP)(nsp1)、3C-半胱氨酸蛋白酶(nsp

2、2)和絲氨酸蛋白酶(nsp4)裂解成14個(gè)不同功能的非結(jié)構(gòu)蛋白。其中的nsp1α可抑制IκB的磷酸化，從而抑制NF-κB的激活基因，導(dǎo)致NF-κB的失活，進(jìn)而抑制IFN-β的產(chǎn)生。nsp11可通過觸發(fā)dsRNA來調(diào)節(jié)PIG-1介導(dǎo)的信號通路抑制IFN-β的產(chǎn)生。
　　RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA啟動(dòng)的特異性沉默機(jī)制，可抑制或關(guān)閉相關(guān)序列基因的表達(dá)，近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RNAi技術(shù)

3、已經(jīng)廣泛應(yīng)用在動(dòng)物傳染病的防治、癌癥、基因功能的研究等各個(gè)領(lǐng)域。siRNA同內(nèi)切核酸以及其他蛋白一同形成RISC(RNA-induced silencing complex)。其中核酸部分可引導(dǎo)蛋白部分降解mRNA，阻斷靶基因翻譯成蛋白質(zhì)。
　　本研究人工設(shè)計(jì)并合成PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1α和nsp11的siRNA，將對應(yīng)的siRNA分別與重組質(zhì)粒pcDNA3.1-nsp1α-GFP，pcDNA3.1-nsp11-GFP共轉(zhuǎn)染

4、293T細(xì)胞，MARC-145細(xì)胞。通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中nsp1α和nsp11蛋白表達(dá)量，Western Blot試驗(yàn)檢測nsp1α和nsp11蛋白表達(dá)量，間接免疫熒光試驗(yàn)檢測病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，以及在MARC-145細(xì)胞中病毒TCID50的測定，揭示siRNA對PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1α和nsp11表達(dá)的抑制效果。
　　熒光倒置顯微鏡的觀察結(jié)果顯示，靶向siRNA可抑制重組基因蛋白的表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示