siRNA對HBV復(fù)制的抑制作用研究.pdf

1、人類乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是正嗜肝脫氧核糖核酸(DNA)病毒屬的一個成員，其基因組是一個長約3.2kb的不完全雙鏈環(huán)狀DNA，其長鏈上有4個開放閱讀框架(open reading frame，ORF)，分別稱為S、C、P和X，編碼外膜蛋白、核殼蛋白、聚合酶和X蛋白。HBV雖然是DNA病毒，但在其復(fù)制過程中存在一個從前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄到DNA的重要環(huán)節(jié)，病毒一旦進入宿主體內(nèi)后，具有雙鏈環(huán)狀的病毒DNA

2、在人體內(nèi)進行復(fù)制，病毒長期持續(xù)的感染，最終導(dǎo)致慢性乙型肝炎的形成，通常情況下，病毒在人體內(nèi)經(jīng)歷數(shù)十年的持續(xù)感染，可導(dǎo)致肝硬化的形成，最終超過三分之一的肝硬化患者會直接導(dǎo)致肝癌的生成。 慢性HBV感染的抗病毒治療一直是醫(yī)學(xué)界的重大難題?，F(xiàn)臨床上被批準的用于治療慢性乙型肝炎的抗病毒藥物主要有拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋等核苷酸類似物。在若干年的臨床治療過程中人們發(fā)現(xiàn)，這些藥物對乙型肝炎e抗原(hepatitis B e Antige

3、n，HBeAg)的有效清除以及HBV DNA的抑制，都起到了一定的效果，但是在臨床上對患者長期的治療過程中，由于藥物長期作用，病毒所出現(xiàn)的耐藥性突變亦是我們不可忽視的。病毒耐藥性突變的出現(xiàn)，導(dǎo)致隨后對病毒的治療效果不佳，這也是臨床上對慢性HBV感染的抗病毒治療所急需解決的問題。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指當(dāng)細胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(double stranded RNA，

4、dsRNA)時，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。這一現(xiàn)象廣泛存在于自然界各級生物體當(dāng)中，是生物體清除病毒等外源性核酸或突變及異常表達內(nèi)源性基因的一種自我保護機制。在哺乳動物中，短至21-23nt的雙鏈RNA可以作為小干擾RNA分子(small interfering RNAs，siRNA)與Di

5、cer以及其它蛋白因子共同形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC中的siRNA以其反義鏈與互補的mRNA結(jié)合，置換出正義鏈。雙鏈mRNA被相關(guān)酶識別，導(dǎo)致整條mRNA鏈被降解，進而抑制相應(yīng)基因的表達。近幾年來國內(nèi)外有多篇文獻報道了siRNA對HBV復(fù)制抑制作用的研究，相關(guān)的研究數(shù)據(jù)亦表明了siRNA分子對降低HBV的基因組相關(guān)被抑制基因的表達起到了較好的效果。但是絕大多

6、數(shù)的實驗設(shè)計都是針對HBV基因組中的核心蛋白(core protein，C)、聚合酶蛋白(polymerase protein，P)和表面蛋白(surface protein，S)而言的。HBV X蛋白(X protein，X)是HBV基因組的重要結(jié)構(gòu)部分，通過以往的研究結(jié)果人們推測HBX在肝癌的形成過程中起到了很大的推動作用，作為一個多功能調(diào)節(jié)蛋白而言，HBX通過與宿主肝細胞中相關(guān)因子的相互影響，在對病毒轉(zhuǎn)錄、細胞信號傳導(dǎo)、周期調(diào)控與

7、細胞凋亡的過程中均有不同程度的作用。 本研究選用HBX作為作用靶點，采用RNA干擾技術(shù)進行抗HBV感染的嘗試。首先建立了HBV-adr亞型細胞模型(HepG2.2.15細胞)，并將所篩選的三條抗HBV的特異siRNA序列導(dǎo)入HepG2.2.15細胞，通過real-time RT-PCR分析細胞中HBx mRNA在抑制后的表達水平同時運用Western blot檢測乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface anti