復(fù)制缺陷的HBV重組體對(duì)野毒株的抑制作用.pdf

1、盡管有高效的疫苗進(jìn)行預(yù)防,臨床上也開始使用多種抗病毒藥物如干擾素-α僅(IFN-α)及核苷類似物等進(jìn)行治療,但慢性乙型肝炎仍嚴(yán)重威脅著人們的健康。近年來基因治療在抗HBV治療方面取得了較大進(jìn)展,如核酶、Dominantnegative突變體(DN突變體)和小干擾RNA(siRNA)等。本課題用腺病毒載體基因改造的類似方法重組HBV基因組,保留HBV的包裝信號(hào),在X基因翻譯起始部位引入終止子以終止X蛋白的表達(dá),全長的C基因與S基因融合使C

2、-S融合蛋白取代包裝所需的核衣殼蛋白和表面蛋白,在重組HBV基因組后通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site,IRES)連接了IL-2基因,構(gòu)建了雙表達(dá)載體。該重組HBV基因組利用HBV的天然嗜肝特性,在患者肝細(xì)胞內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性利用HBV野毒株的C蛋白和S蛋白包裝病毒,將C、S蛋白融合產(chǎn)生的DN突變體的抗HBV作用在有野毒株存在的肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)、放大作用；不表達(dá)X蛋白,消除了X蛋白的反式激活、損害宿主細(xì)胞

3、的不利影響；并利用IRES同時(shí)表達(dá)IL-2以增強(qiáng)抗HBV的作用。 一、基于腺病毒載體HBV復(fù)制缺陷重組體的構(gòu)建 以含1.3拷貝HBV野毒株基因組的質(zhì)粒1.3×wt HBV in pGEM3Z(p1.3HBV)為模板,分別以Kpn I/Xba I、Xba I/Hind Ⅲ酶切并將酶切得到的2.4Kb、1.8Kb的HBV基因片斷克隆至pUC19載體,使p1.3HBV含有的兩個(gè)X基因克隆至pUC19載體,命名為2.4Kb/pU

4、C19(還包含C基因和S基因的起始部分)和1.8Kb/pUC19。用定點(diǎn)突變?cè)噭┖?設(shè)計(jì)引物使X基因的第8位氨基酸的密碼子從CAA突變成終止密碼子TAA。同樣的方法,以2.4Kb/pUC19質(zhì)粒為模板,以限制性內(nèi)切酶MluI位點(diǎn)(-ACGCGT-)取代C基因終止子密碼子,且在S基因起始密碼子前插入MluI酶切位點(diǎn)。用Mlu I單酶切該突變質(zhì)粒以切除C基因末端與S基因起始密碼子之間的序列,回收的大片斷以T4連接酶連接產(chǎn)生CS融合基因。再次

5、設(shè)計(jì)引物,刪除C、S基因之間的Mlu I酶切位點(diǎn)(-ACGCGT-),并將CS+X-克隆到腺病毒載體PDC316上構(gòu)建成CS+X/PDC316。 二、CS+X--IRES-IL-2/PDC316雙表達(dá)重組體的構(gòu)建 以質(zhì)粒IRES/pMD18-T為模板,設(shè)計(jì)引物經(jīng)PCR反應(yīng)在IRES基因片斷兩端引入Sal I酶切位點(diǎn),克隆到載體pMD18-T。經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定后以Sal I單酶切質(zhì)粒,將IRES克隆至PDC316質(zhì)粒載體。

6、以BamHI酶切IL-2/MNSM,將切下的IL-2基因定向克隆到IRES/PDC316質(zhì)粒,構(gòu)建了IRES-IL-2/PDC316質(zhì)粒。以Sal I酶切IRES-IL-2/PDC316質(zhì)粒,將IRES-IL-2基因片斷定向克隆到CS+X-/PDC316,構(gòu)建了的CS+X--IRES-IL-2/PDC316雙表達(dá)質(zhì)粒。 三、復(fù)制缺陷的乙型肝炎病毒重組體抑制野毒株作用的體外研究 將PCH3143質(zhì)粒上的缺失包裝信號(hào)的HBV

7、基因組克隆至PDC316載體構(gòu)建成輔助質(zhì)粒3143/PDC16。應(yīng)用脂質(zhì)體將構(gòu)建的CS+X-IRES-IL-2/PDC316、CS+X-/PDC316與輔助質(zhì)粒3143/PDC16共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,并分別以質(zhì)粒CS+X--IRES-IL-2/PDC316、1.3HBV/PDC316、3143/PDC316單獨(dú)轉(zhuǎn)染為對(duì)照。轉(zhuǎn)染后48d,時(shí),1)以MTT比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的毒性；2)以RT-PCR檢測(cè)CS+X--IRES-IL-2

8、/PDC316轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的表達(dá),以雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-2;3)提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒顆粒,以過量的DNaseI消化過剩的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后進(jìn)行PCR以檢測(cè)上清中的HBV顆粒。結(jié)果證實(shí)：1)轉(zhuǎn)染復(fù)制缺陷的HBV重組體對(duì)細(xì)胞無毒性作用；2)單獨(dú)轉(zhuǎn)染復(fù)制缺陷的HBV重組體可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生C-S融合蛋白,上清中的IL-2的表達(dá)量為(7.89±0.21ng/ml),但該重組體不能包裝成病毒顆粒分泌至細(xì)胞上清中；

9、3)復(fù)制缺陷的HBV基因組在HBV輔助質(zhì)粒3143/PDC316的幫助下能有效復(fù)制并包裝成子代病毒顆粒分泌到胞外。 為觀察復(fù)制缺陷的HBV重組體對(duì)野毒株的作用,將HepG2細(xì)胞分別用以下質(zhì)?；蛑亟M體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染：1)CS+X-/PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316質(zhì)粒,2)CS+X--IRES-IL-2/PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316,3)PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316。轉(zhuǎn)染后48小

10、時(shí)收集培養(yǎng)的細(xì)胞和上清進(jìn)行用定量PCR進(jìn)行HBV的定量檢測(cè)檢測(cè)。結(jié)果顯示,三組細(xì)胞中的HBV定量分別為6.45×106copies/ml、5.75×106copies/ml和2.23×107copies/m,CS+X-/PDC316、CS+X--IRES-IL-2/PDC316對(duì)野毒株的抑制率分別為71.08％、75.29％,上清中的病毒定量分別為4.06×106copies/ml,5.06×106copies/ml和1.87×107

11、copies/ml,CS+X/PDC316、CS+X-IRES-IL-2/PDC316對(duì)野毒株的抑制率分別為74.20％、72.94％。這些結(jié)果表明,復(fù)制缺陷的HBV重組體在體外能有效抑制HBV野毒株的復(fù)制。 結(jié)論：課題成功構(gòu)建了一種全新的、基于腺病毒載體、能表達(dá)IL-2的復(fù)制缺陷HBV重組體。該重組體與包裝信號(hào)序列缺失的輔助質(zhì)粒PCH3143共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后可進(jìn)行包裝、復(fù)制,與HBV野毒株共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞則可顯著抑制