sbhl對(duì)hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的影響

1、<p>　　SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的影響</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 端粒酶 </p><p>　　【Abstract 】 AIM: To observe the inhibiting effects of SBHL on the growth of HeLa cells and to investigate the inhibiting mechanisms.

2、 METHODS: The proliferation of HeLa cells was observed by MTT assay and the changes of the cell cycle of HeLa cells treated with SBHL were analyzed by flow cytometry. The expressions of hTRT gene were detected by immunoh

3、istochemistry techniques and the differentiation of HeLa cells was observed by WrightGiemsa staining. RESULTS: The proliferation of HeLa cells was i</p><p>　　【Keywords】 SBHL; HeLa cell; telomerase; flow cyto

4、metry; cell cycle; cell differentiation </p><p>　　【摘要】 目的：觀察SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并探討其作用機(jī)制. 方法：用MTT比色法觀察不同濃度SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響；用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析；用免疫組化方法觀察SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,

5、hTRT)基因表達(dá)的影響. 用瑞氏姬姆薩染色法觀察SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)的影響. 結(jié)果：0.1~20.0 mg/L SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，這種抑制作用隨SBHL濃度的增加而增加；流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，隨著SBHL濃度的增加，S期細(xì)胞含量逐漸降低，G1期細(xì)胞含量逐漸增加，SBHL將細(xì)胞阻滯于G1期，抑制DNA合成. SBHL處理的HeLa細(xì)胞與對(duì)照組相比， hTRT基因的表達(dá)明顯降低；瑞氏姬姆薩

6、染色結(jié)果表明SBHL可使HeLa細(xì)胞向良性分化. 結(jié)論：SBHL明顯抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)呈濃度依賴(lài)性. SBHL下調(diào)HeLa細(xì)胞hTRT基因的表達(dá)，抑制端粒酶活性. </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 SBHL；HeLa細(xì)胞；端粒酶；流式細(xì)胞術(shù)；細(xì)胞周期；細(xì)胞分化 </p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　龍葵為茄科茄屬

7、植物，全草入藥. 龍葵具有清熱解毒、化痰止咳等作用. 藥理實(shí)驗(yàn)表明有抗菌、消炎、抗腫瘤等作用［1］. SBHL是從龍葵濃縮果汁中提取出的一種游離的生物堿鹽酸鹽，在此鹽分子上增加活性基團(tuán)，保持其原有生物學(xué)活性基礎(chǔ)上，使其產(chǎn)生新的高效活性. Putalun等［2］對(duì)龍葵的成分、分離方法、抗凝血及抗腫瘤作用進(jìn)行了研究. 龍葵總生物堿或其中成分有抑制腫瘤作用，而由龍葵總生物堿轉(zhuǎn)化而成的有效成分SBHL，其抗腫瘤活性及抗腫瘤作用機(jī)制無(wú)報(bào)道. 我們

8、觀察了不同濃度SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并探討了SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的機(jī)制. </p><p><b>　　1材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1材料 </b></p><p>　　HeLa細(xì)胞由長(zhǎng)春腫瘤研究所提供; SBHL由北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉良教授提供，用二蒸水配置成貯液.

9、用RPMI 1640培養(yǎng)液配制成終濃度為0.01, 0.1, 1.0, 10.0和20.0 mg/L. RPMI 1640, 胰蛋白酶和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；MTT, PI和DMSO均為Sigma公司產(chǎn)品. DAB顯色試劑盒和通用型SP試劑盒和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司. </p><p&

10、gt;<b>　　1.2方法 </b></p><p>　　用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，以不同濃度梯度SBHL作用于HeLa細(xì)胞，每個(gè)濃度3個(gè)孔，同時(shí)設(shè)不加SBHL對(duì)照孔，培養(yǎng)液空白孔，對(duì)照孔各3孔. 培養(yǎng)5 d，每日取1板，加入 MTT(1 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，移去上清并用吸水紙吸干培養(yǎng)液，再加入DMSO，振蕩至結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定A490 nm.

11、將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞加入25 mL培養(yǎng)瓶中，當(dāng)80%～90%細(xì)胞匯合時(shí)，加SBHL作用72 h，用胰酶消化收集細(xì)胞， PBS洗2次， 4℃固定24 h后，加入RNase，37℃水浴消化1 h，再加入PI，避光4℃染色30 min 200目網(wǎng)篩濾過(guò)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)HeLa細(xì)胞周期變化. 將1.0 mg/L SBHL加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)72 h,消化成單個(gè)細(xì)胞，將其涂在玻片上，加丙酮固定. 按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作. 用SP免疫

12、組化法分別檢測(cè)HeLa細(xì)胞hTRT基因的表達(dá)，圖片置于攝像顯微鏡下，選取觀察部位. 隨機(jī)選取3~5個(gè)視野，在圖像分析儀下測(cè)定灰度值，灰度值用Y=0.299R+0.587G+0.114B計(jì)算. 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶消化，制</p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 10.0軟件處理，兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn). </p><p><b>　　2結(jié)果 </b></

13、p><p>　　2.1MTT比色法0.01 mg/L SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用與對(duì)照組相似(P&gt;0.05)，0.1～20.0 mg/L SBHL處理的HeLa細(xì)胞組與對(duì)照組相比均有顯著性差異（P&lt;0.05）,說(shuō)明0.1～20.0 mg/L SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，而且隨著SBHL濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)(Tab 1, Fig 1).表1SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞

14、的生長(zhǎng)抑制作用（略） </p><p>　　2.2流式細(xì)胞術(shù)經(jīng)SBHL作用后HeLa細(xì)胞G1期增加，S期減少，說(shuō)明SBHL可以將細(xì)胞阻滯于G1期，抑制DNA合成(Tab 2).表2SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響（略） </p><p>　　2.3hTRT基因表達(dá)未經(jīng)SBHL處理的HeLa細(xì)胞核染成棕黃色陽(yáng)性(Fig 2A). 10.0~20.0 mg/L </p><

15、p>　　SBHL處理的HeLa細(xì)胞72 h后，細(xì)胞核被染成棕黃色的HeLa細(xì)胞明顯減少，大部分細(xì)胞核染成藍(lán)色，呈陰性(Fig 2B)，表明hTRT基因表達(dá)受到明顯抑制. </p><p>　　2.4HeLa細(xì)胞形態(tài)經(jīng)瑞氏姬姆薩染色，光鏡觀察可見(jiàn)未經(jīng)SBHL處理的HeLa細(xì)胞排列密集，細(xì)胞呈圓形，大小不一，瘤巨細(xì)胞多見(jiàn)；細(xì)胞核質(zhì)比例大，核大、核仁多;而SBHL處理組細(xì)胞隨藥物濃度增大細(xì)胞排列稀疏，呈長(zhǎng)梭形或多

16、邊形，胞質(zhì)伸出長(zhǎng)的不規(guī)則突起，相互聯(lián)接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞大小趨向一致，瘤巨細(xì)胞少見(jiàn)；細(xì)胞核、質(zhì)比例增大，核小，且核仁減少，染色變淺(Fig 3A,B). </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　SBHL是從龍葵中提取出的龍葵總生物堿，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后的主要活性成分，其抑制腫瘤作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道. 我們觀察到0.1~20.0 mg/L SBHL對(duì)H

17、eLa細(xì)胞具有明顯的抑制作用. 對(duì)HeLa細(xì)胞周期有明顯的影響，G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，說(shuō)明SBHL可以將細(xì)胞阻滯于G1期，抑制DNA合成. </p><p>　　SBHL可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞形態(tài)趨向良性分化，部分恢復(fù)正常細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞排列稀疏，呈長(zhǎng)梭形或多邊形，胞質(zhì)伸出長(zhǎng)的不規(guī)則突起，相互聯(lián)接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞大小趨向一致，瘤巨細(xì)胞少見(jiàn)；核小，且核仁減少，染色變淺. 細(xì)胞功能的體現(xiàn)也是腫瘤細(xì)胞分化的標(biāo)志. 從

18、功能方面來(lái)看，細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂和集落形成均顯示HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制. 同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)分析DNA周期也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被阻止于G1期，S期細(xì)胞百分率下降. 端粒酶是一種依賴(lài)RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶，能夠延長(zhǎng)染色體末端的端粒長(zhǎng)度. 正是端粒酶的活化通過(guò)對(duì)端粒長(zhǎng)度的維持 使細(xì)胞得以永生化，而永生化也正是細(xì)胞惡變的必經(jīng)步驟［3］. 端粒酶在正常人體細(xì)胞中并不表達(dá)，在多種腫瘤中均可檢出端粒酶活性［4,5］. 端粒酶催化亞單位即hTRT是細(xì)胞永生化及惡性

19、腫瘤發(fā)生過(guò)程中的端粒酶活化的主要限速步驟，hTRT基因表達(dá)可以反映端粒酶活性，與端粒酶活性具有平行關(guān)系. 我們發(fā)現(xiàn)未用SBHL處理的HeLa細(xì)胞hTRT基因高度表達(dá)，用SBHL處理后的HeLa細(xì)胞hTRT基因表達(dá)明顯降低. 因此，SBHL可能通過(guò)下調(diào)hTRT基因表達(dá)，抑制端粒酶活性，使細(xì)胞分裂中端粒逐漸縮短，最終</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p>&l

20、t;p>　?。?］ 謝啟梅，謝軍榮. 龍葵在腫瘤治療中的應(yīng)用［J］. 江西中醫(yī)藥，1996; 27(2):52-53. </p><p>　　Xie QM, Xie JR. The use of solamargine treated on tumors［J］. Jiangxi Chin Drug, 1996;27(2):52-53. </p><p>　?。?］ Putalun W

21、, Tanaka H. Survey of solasodinetyRe glycoalkaloids by western blotting and ELISA using antisolamargine monoclonal antibody［J］. Biol Pharm Bull, 2000;23（1）：72-75. </p><p>　?。?］ Huschtscha LI， Bartier WA， And

22、ersson CE, et al. Characteristics of cancer cell death after exposure to cytotoxic drugs in vitro［J］. Br J Cancer, 1996;73:54-60. </p><p>　?。?］ Mandal M, Maggrrar SB, Sharma N, et al. Bcl2 prevent CD95 (Fas/

23、APOI) induced degradatron of lamin B and Ply(Aopribose) polymerase and restores the NFKB signaling Pathway［J］. J Biol Chem, 1996;271：30354-30359. </p><p>　?。?］ Li H, Caoy, Berndtmc, et al. Molecular interact