1,3-O,N螺雜環(huán)類乙酰肝素酶抑制劑對宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長抑制作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景及目的:
  宮頸癌是我國最常見的婦科惡性腫瘤,隨著細(xì)胞學(xué)聯(lián)合病毒學(xué)篩查機(jī)制逐步完善及HPV疫苗的批準(zhǔn)使用,子宮頸癌的早期病變得以及時(shí)發(fā)現(xiàn),世界范圍內(nèi)宮頸癌的發(fā)病率已明顯降低,但在發(fā)展中國家宮頸癌發(fā)病率逐漸增高和發(fā)病年輕化的勢頭并沒有得到有效遏制。而晚期、持續(xù)性和復(fù)發(fā)性宮頸癌是臨床處理的難點(diǎn),治療緩解率低,目前主要是采用化療來緩解癥狀,減少腫瘤的負(fù)荷。許多臨床研究報(bào)告顯示,單一化療藥物不能很好提高患者的總生存率,多藥聯(lián)合化療提

2、高了反應(yīng)率,但對遠(yuǎn)期生存率并沒有顯著地改善。因而,需要開發(fā)不同作用機(jī)制的藥物,探索新的治療方法,而分子靶向治療藥物成為人們解決宮頸癌治療困境的重要選擇。
  腫瘤獲得侵襲與轉(zhuǎn)移能力依賴的一個(gè)重要方面就是基底膜完整性遭到破壞,其中,硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中非結(jié)構(gòu)蛋白的重要組成部分,它由一個(gè)核心蛋白通過糖苷鍵和數(shù)個(gè)與之共價(jià)連接的線性HS側(cè)鏈組成,其降解對于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要的促進(jìn)作用。乙酰肝素酶(

3、Heparanase,HPA)作為體內(nèi)唯一存在的內(nèi)源性糖苷類內(nèi)切酶,其水解位點(diǎn)正是HSPG中硫酸乙酰肝素( HS)側(cè)鏈與其核心蛋白相連的糖苷鍵,通過調(diào)節(jié)HSPG的結(jié)構(gòu)和功能影響生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞行為,其在許多惡性腫瘤中的高表達(dá)使其受到越來越多的關(guān)注,成為癌癥治療的分子靶點(diǎn)。在我們課題組之前的一系列研究中已經(jīng)證實(shí)HPA在宮頸癌組織中呈高表達(dá),癌組織轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)也顯著增高,轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中乙酰肝素酶陽性宮頸癌患者預(yù)后差。
  本

4、研究以HPA為中心開發(fā)新的靶點(diǎn)作用分子,設(shè)計(jì)合成了一系列1,3-O,N螺雜環(huán)類HPA抑制劑,觀察它們對宮頸癌HeLa細(xì)胞的體外生長抑制作用和對細(xì)胞周期、凋亡及HPA蛋白表達(dá)的影響,為宮頸癌HPA靶向抑制治療提供理論支持。
  材料與方法:
  通過改變 HS的吡喃糖苷類模擬物 DMBO(2-(2,6-二氟苯基)-5-(4-甲氧基苯基)-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷)上取代基的種類及位置,與鄭州大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院合作優(yōu)化設(shè)計(jì)合

5、成了兩個(gè)系列13種新的1,3-O,N螺雜環(huán)類HPA抑制劑;利用乙酰肝素降解檢測試劑盒檢測化合物對 HPA酶活性的抑制作用;復(fù)蘇并培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞株,MTT法和細(xì)胞劃痕法觀察抑制劑對宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長和遷移抑制效應(yīng);流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期變化和凋亡狀況;細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測細(xì)胞HPA蛋白表達(dá)水平變化。
  結(jié)果:
  1. HPA抑制劑對HPA酶活性的影響
  除22號化合物(2-(2,4-二氟苯基)-5-(

6、4-甲氧基苯基)-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷)酶抑制作用不明顯外,所檢測的HPA抑制劑均可不同程度地抑制HPA酶活性(IC50值為4.47-47.19μM),其中抑制作用最好的是14號(2-(2,6-二氟苯基)-5-苯基-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷),其次為16號(2-(2-氟苯基)-5-(4-甲氧基苯基)-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷)。
  2. HPA抑制劑對宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長抑制作用
  所檢測的化合

7、物均可抑制HeLa細(xì)胞生長(IC50值為48.158-96.641μM),其中16號抑制劑對HeLa細(xì)胞生長抑制作用最強(qiáng),存在明顯的時(shí)間依賴和濃度依賴性,P<0.001。
  3.化合物16號對HeLa細(xì)胞遷移效應(yīng)的影響
  與對照組相比,50μM(接近IC50)16號抑制劑處理HeLa細(xì)胞24小時(shí)后可顯著抑制細(xì)胞遷移。
  4.化合物16號對HeLa細(xì)胞周期及凋亡的影響
  流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:抑制劑處理后使

8、HeLa細(xì)胞阻滯在 G0/G1期和 G2/M期;50μM的16號抑制劑作用48小時(shí)后細(xì)胞凋亡率((11.93±1.16)%)顯著高于對照組((6.65±1.81)%),P=0.0131。
  5.化合物16號對HeLa細(xì)胞HPA蛋白表達(dá)的影響
  50μM的16號抑制劑處理細(xì)胞后,細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示處理組細(xì)胞爬片乙酰肝素酶蛋白平均光密度值(0.3933±0.0363)顯著低于對照組(0.5000±0.0937), P=0.

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