茯苓多糖抑制宮頸癌hela細胞增殖的研究.pdf

1、目的:宮頸癌(cervical carcinoma)是女性最常見的一種惡性腫瘤，居第二位?；瘜W(xué)藥物治療為中、晚期宮頸癌，轉(zhuǎn)移、擴散或復(fù)發(fā)宮頸癌患者的姑息治療方法，化療藥物在致腫瘤細胞死亡的同時對機體正常細胞產(chǎn)生不同程度的毒副作用,且長時間應(yīng)用化療藥物后，常出現(xiàn)腫瘤細胞對化療藥物的耐藥反應(yīng)，最終導(dǎo)致化學(xué)藥物治療宮頸癌方法失敗。如能尋找對腫瘤細胞具有強靶作用、且有一定療效的新型制劑治療宮頸癌，或利用它們增加現(xiàn)有化療藥物的化療效果，改善目前的

2、化療狀況就顯得極其重要。本實驗旨在研究茯苓多糖(Pachymaram)對人宮頸癌hela細胞株增殖的作用，及與紫杉醇聯(lián)合用藥對人宮頸癌hela細胞株體外生長的影響，以期在臨床上改善藥物治療宮頸癌現(xiàn)狀，為制定宮頸癌化療方案提供新思路。
　　方法:
　　1．細胞培養(yǎng)：常規(guī)方法復(fù)蘇凍存于液氮罐中的宮頸癌hela細胞，離心、洗滌后，制成單細胞懸液，接種于含10％小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37℃,5%二氧化碳飽和

3、濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察細胞生長情況，待細胞生長至80%融合時(約3-5天)，胰酶消化，制成單細胞懸液，以備實驗用。
　　2．染料排斥法測定：把制備成單個細胞的懸液用培養(yǎng)液稀釋五倍，取9滴細胞懸液移入試管中，加1滴0.4%臺盼藍溶液，混勻，在3min內(nèi)，用血球計數(shù)板計數(shù)活細胞數(shù)。
　　3．流式細胞儀測定：取對數(shù)生長期細胞，既細胞生長達80%融合時，常規(guī)消化制成單細胞懸液，以1×105/ml密度接種于培養(yǎng)瓶中，24h后換液，

4、加入藥物或培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，收集所有細胞，將約1×105個細胞移入離心管中，1000rpm離心8分鐘，棄去上清后，連續(xù)兩次，用PBS溶液清洗一次，在離心管中留約0.5mlPBS，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，加入70％冰乙醇5ml混勻固定，4℃放置48h以上，檢測時，離心離去乙醇，沉淀物經(jīng)PBS離心洗滌2次，在離心管中留1mlPBS，打散細胞團，以500目銅網(wǎng)過濾成單細胞懸液，濃度約為1*105個/ml。加入Rnase5ul(10mg/ml)，

5、37℃放置1h，以消除RNA的干擾，離心，用冷PBS洗一次，加入PI（100ug/ml）染液，室溫避光染色30分鐘，計數(shù)1×104個細胞，流式細胞儀分析細胞凋亡率和細胞周期，測得的數(shù)據(jù)和圖形輸入 B.D公司提供的流式細胞分析軟件，以低于G1期DNA含量的細胞為凋亡細胞，應(yīng)用相應(yīng)程序進行資料處理。
　　結(jié)果:
　　1、倒置像差顯微鏡觀察：實驗組細胞形態(tài)欠規(guī)則，偽足回縮，細胞質(zhì)濃縮，細胞核核仁染色不均，細胞核核物質(zhì)分散，細胞深染

6、，凋亡小體出現(xiàn)。對照組細胞生長良，細胞透明，呈復(fù)層性生長，細胞呈梭形或多角形，易融合形成集落，細胞漿內(nèi)顆粒較少，細胞核隱約可見。
　　2、臺盼藍染料排斥法檢測：顯示茯苓多糖對宮頸癌hela細胞體外生長的增殖有抑制作用，經(jīng)細胞計數(shù)后，描繪生長曲線圖可知，經(jīng)不同濃度茯苓多糖處理后的hela細胞較對照組生長緩慢，表現(xiàn)出明顯的生長抑制，而對照組細胞生長良好，呈典型的生長曲線圖。經(jīng)臺盼藍染料染色后，在光鏡下計數(shù)活細胞數(shù)，結(jié)果表明，與對照組比

7、較活細胞數(shù)減少，統(tǒng)計學(xué)分析差異有顯著性。茯苓多糖單獨用藥，濃度分別為（3mg/ml,6mg/ml,12mg/ml)對 hela細胞體外生長均具有抑制增殖作用，經(jīng)不同濃度的茯苓多糖處理細胞后，與對照組相比，差異具有顯著性，且隨著茯苓多糖藥物濃度的增大、茯苓多糖作用時間的延長，活細胞數(shù)隨之下降。綜上結(jié)果表明，茯苓多糖對 hela細胞的增殖抑制作用有明顯的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)依賴關(guān)系。茯苓多糖(3mg/ml)與紫杉醇(0.043mg/ml)

8、聯(lián)合用藥作用 hela細胞后，與對照組或與單獨應(yīng)用紫杉醇組（0.043mg/ml）相比，活細胞數(shù)差異具有顯著性，上述結(jié)果表明，茯苓多糖與紫杉醇聯(lián)合用藥對 hela細胞的增殖抑制作用具有協(xié)同作用。
　　3、流式細胞儀檢測hela細胞周期分布和凋亡顯示：用藥24小時后，隨藥物濃度增大，G2/M期比例逐漸增多，S期比例則逐漸減少，且出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，凋亡百分率茯苓多糖組分別為1.9%、3.3%、10.3%;紫杉醇組為2.6%，聯(lián)

9、合用藥組為9.2%。上述結(jié)果表明，茯苓多糖用藥24小時后可阻滯hela細胞周期進程于G2/M期，茯苓多糖與紫杉醇聯(lián)合用藥組，24小時可阻滯hela細胞周期進程于G2/M期，比例較單獨應(yīng)用紫杉醇組增高。
　　結(jié)論:
　　1、本試驗首次通過體外試驗證實茯苓多糖單獨應(yīng)用對 hela細胞的體外生長有增殖抑制作用，增殖抑制作用呈劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)依賴關(guān)系。
　　2、本試驗證實應(yīng)用茯苓多糖可阻滯宮頸癌hela細胞周期于G2/M