固有免疫識別分子IFI16對HBV cccDNA抑制作用及其分子機(jī)制.pdf

1、人類乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界性的衛(wèi)生難題，嚴(yán)重威脅人類健康，它可以導(dǎo)致肝炎、肝硬化甚至肝癌。盡管已有預(yù)防性疫苗的存在，全世界仍有2億4000萬人是HBV的慢性感染者。每年，都有超過60萬的人群死于慢性乙型肝炎感染。HBV為專一的嗜肝DNA病毒，其基因組呈部分環(huán)狀、松弛、非閉合的雙鏈結(jié)構(gòu)，稱為松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)。在乙肝病毒復(fù)制過程中，rcDNA進(jìn)入細(xì)胞核后，在DNA聚合酶的作用下

2、，兩條鏈的缺口被補(bǔ)齊，形成超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子(covalently closed circular DNA，cccDNA)。在感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，HBVcccDNA可以和組蛋白以及非組蛋白形成微染色體，并作為病毒基因組轉(zhuǎn)錄的模板，合成HBV前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)以及其他HBV的轉(zhuǎn)錄本。雖然cccDNA含量較少，每個(gè)肝細(xì)胞只有約5-50個(gè)拷貝，但其對于乙肝病毒的復(fù)制和感染狀態(tài)的建立具有十分重要

3、的意義，是導(dǎo)致HBV持續(xù)性感染以及抗病毒藥物停藥后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。因此，以cccDNA作為靶標(biāo)是抗HBV研究中的一個(gè)重要研究方向。越來越多的證據(jù)表明，抗病毒固有免疫的有效活化在抗HBV感染中起到重要作用，而宿主對HBV的免疫識別是固有免疫活化的關(guān)鍵一步。但目前是否有識別cccDNA的固有免疫感受器，以及識別后所發(fā)生的生物學(xué)效應(yīng)仍不清楚。
　　本研究通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測可能與HBVcccDNA結(jié)合的固有免疫感受器。結(jié)果發(fā)現(xiàn)干

4、擾素誘導(dǎo)蛋白16(gamma-interferon-inducible protein16，IFI16)，而非環(huán)化二核苷酸合成酶(Cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)、人黑色素瘤缺乏因子(Absent in melanoma2，AIM2)和骨髓細(xì)胞核分化抗原(Myeloid cell nuclear differention antigen，MNDA)等固有免疫感受器，可有效識別肝細(xì)胞核內(nèi)的HBV cccDNA，且

5、HBV感染可能下調(diào)IFI16的表達(dá)。在肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞中過表達(dá)IFI16可有效抑制HBV cccDNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，表現(xiàn)為IFI16轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HBV抗原（HBsAg和HBeAg）、HBV轉(zhuǎn)錄本（HBVpgRNA和HBV RNAs）和HBVDNA水平的明顯下調(diào);而在HBVcccDNA小鼠模型中外轉(zhuǎn)IFI16的小鼠同源基因p204亦得到類似現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，利用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)IFI16的表達(dá)后可明顯促進(jìn)HBV cccD

6、NA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。機(jī)制研究方面，本文的結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為ALR(AIM2-1ike receptor)家族成員，IFI16在HBV cccDNA模型中并不能明顯激活炎癥小體(inflammasome)，而導(dǎo)致了Ⅰ型干擾素(typeⅠIFN)信號通路的活化;但阻斷IFN信號通路后并不能明顯逆轉(zhuǎn)IFI16對HBV cccDNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制作用，這提示IFI16還可能通過其他機(jī)制抑制HBV cccDNA。已有研究表明HBV cccDNA的表

7、觀遺傳修飾在HBV的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，IFI16處理可明顯影響HBV cccDNA的表觀遺傳修飾、促進(jìn)cccDNA的異染色質(zhì)化，表現(xiàn)為在外轉(zhuǎn)IFI16的細(xì)胞中，與cccDNA結(jié)合的乙酰化組蛋白（AcH3和AcH4）水平下調(diào)、常染色質(zhì)marker(H3K4me3)水平下調(diào)、異染色質(zhì)marker(H3K9me3)的水平上調(diào)、組蛋白去乙?；窰DAC1和Sirt1水平上調(diào)以及組蛋白乙?；竝300和CBP的水平下調(diào)等。進(jìn)一步

8、的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，HBVcccDNA序列上的干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)可能在IFI16對HBV cccDNA的表觀遺傳修飾中發(fā)揮作用，表現(xiàn)為IFI16的表達(dá)可明顯抑制STAT1和STAT2與ISRE的結(jié)合，而將干擾素刺激應(yīng)答元件(Interferon stimulated response element，ISRE)點(diǎn)突變后，IFI16對HBV eccDNA的表觀遺傳修飾(STAT1、STAT2、AcH3、H3K4me3和H3K9me

9、3等與cccDNA的結(jié)合)的影響及對cccDNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制(pgRNA和HBV DNA水平)的抑制作用明顯下調(diào)。
　　總結(jié)以上結(jié)果，本文的研究首次發(fā)現(xiàn)固有免疫感受器IFI16可在肝細(xì)胞核內(nèi)識別HBV cccDNA，并有效抑制cccDNA介導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。IFI16結(jié)合cccDNA并未激活inflammasome，但導(dǎo)致了IFN信號通路的活化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IFI16可通過對cccDNA的表觀遺傳修飾直接抑制cccDNA