LPAR3對人類子宮內膜容受性調控的研究.pdf

1、人類胚胎植入是一個十分復雜的過程，在這個過程中胚胎和子宮內膜互相作用，在一段非常短的時期共同作用完成胚胎著床。一個成功的植入過程需要三個重要的條件:優(yōu)質的胚胎、良好的子宮內膜容受性以及胚胎和子宮內膜的同步發(fā)育。子宮內膜僅在一段十分短暫的時間內具有接受胚胎的能力，這一時期叫做“著床窗口期”。子宮內膜的容受性受到多種生物信號的調控，包括:特殊的生長因子、細胞因子、磷脂分子、細胞粘附因子以及轉錄因子等。這些生物信號受女性甾體激素、前列腺素和肽

2、類激素的調節(jié)，它們的變化會造成子宮內膜容受性的改變，導致胚胎植入率和妊娠率的下降。
　　 溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)是一種具有多生物效應的生長因子。它可以調控細胞的生存、增殖、分化、抑制細胞間的縫隙連接和改變細胞骨架的重新排列。LPA在生殖方面也起到了重要的調控作用，包括刺激卵子的成熟、調節(jié)2～4卵裂球的胚胎向囊胚的轉化、影響胚胎在輸卵管的運輸。LPA主要依靠細胞外基質的溶血磷脂酶D水解磷脂

3、生成，也可以由活化的血小板、紅細胞、有絲分裂后的神經元細胞、卵巢和宮頸癌細胞、脂肪細胞和肥大細胞分泌產生。LPA通過G偶聯(lián)蛋白受體LPAR1-4發(fā)揮生物學效應。敲除LPAR1和LPAR2的雌性小鼠生育能力正常，但是敲除LPAR3基因的雌性小鼠生育能力發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為胚胎植入空間的改變、胚胎纏繞以及種植時間延遲。在小鼠交配后的2.5d，小鼠子宮內膜上LPAR3的表達開始上升，在圍植入期即交配后的3.5d表達達到頂峰，然后在交配后4.5

4、d下降恢復到基礎水平直至分娩后。目前對LPAR3在人類子宮內膜容受性方面的研究很少，僅僅知道反復植入失敗的患者和子宮內膜異位癥的患者在他們月經周期的分泌期LPAR3在其子宮內膜上的表達較正常婦女低。
　　 在控制性超促排卵（Controlled ovarian hyperstimulation，COH）中，由于為了在一個促排卵周期中同時得到多個發(fā)育的成熟卵子，因而使用了大量的促排卵藥物。長效長方案是目前應用的較多的一種促排卵方案

5、，該方案可以獲得優(yōu)質的卵子，受精率和優(yōu)胚率都比較高，但是胚胎的植入率比較低。分析原因，多數(shù)學者認為是由于促排卵藥物的使用造成體內產生超生理濃度的激素，從而干擾了子宮內膜的內環(huán)境，降低了子宮內膜的容受性。因此，找到子宮內膜容受性下降的原因并找到解決的方法，可以提高IVF的妊娠率，具有很好的臨床意義。至今，還沒有文獻報道人類長方案促排卵的患者子宮內膜上LPAR3的表達方式。
　　 多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary s

6、yndrome，PCOS）患者由于體內內分泌紊亂，造成雌孕激素分泌異常和促黃體生成素(LH)的升高，導致子宮內膜上影響子宮內膜容受性的因素表達異常，從而降低了PCOS患者子宮內膜的容受性。目前對PCOS患者的子宮內膜容受性的研究主要集中在對甾體激素及其受體、整合素、基質金屬蛋白酶、同源框基因等因子，對于目前新近發(fā)現(xiàn)在生殖過程中發(fā)揮重要作用的LPAR3的研究甚少，國內外均未見報道。此外在我們研究的臨床部分，我們在改善PCOS患者子宮內膜容

7、受性的原理的基礎上，采用了降調節(jié)人工周期子宮內膜準備的方法，目的是找到一種有效的提高PCOS患者的子宮內膜的容受性的方法。
　　 本研究主要利用RT-PCR，Western blot和免疫組化等技術研究了正常婦女月經周期、IVF促排卵患者圍著床期以及PCOS患者月經周期中子宮內膜LPAR3的表達情況和差異。初步說明了LPAR3在子宮內膜容受性建立過程中的重要作用。研究分為四個部分，前三個部分為實驗部分，最后一個部分為臨床部分，實

8、驗方法和結果如下:
　　 第一部分 LPAR3在正常婦女月經周期子宮內膜上的表達
　　 目的:研究溶血磷脂酸受體3（Lysophosphatidic acid receptor3，LPAR3）mRNA及其蛋白在正常婦女月經周期中子宮內膜上的表達規(guī)律。
　　 方法:采用RT-PCR，Western blot和免疫組化法，檢測LPAR3 mRNA和蛋白在正常婦女月經周期中子宮內膜上的表達規(guī)律。
　　 結果:<

9、br>　　 1.在整個人類月經周期中均可在子宮內膜組織中檢測到LPAR3mRNA和蛋白的表達。
　　 2.在整個增生期LPAR3 mRNA和蛋白的表達呈低表達狀態(tài)，在早分泌期LPAR3 mRNA和蛋白表達明顯升高，并且達到峰值，但是在中分泌期LPAR3 mRNA和蛋白的表達驟然下降，恢復到增生期水平。但在晚分泌期LPAR3 mRNA和蛋白表達又上升，逐級恢復到早分泌期水平。
　　 3.在早增生期LPAR3蛋白主要分布在

10、子宮內膜的腔上皮、腺上皮的細胞漿中。在中晚增生期雖然間質細胞的細胞漿中LPAR3的陽性著色范圍擴大，但仍是主要在子宮內膜的腺上皮和腔上皮細胞的胞漿中呈陽性表達。在早分泌期腺上皮和子宮內膜腔上皮細胞呈強陽性免疫染色，間質細胞也出現(xiàn)強陽性反應。在中分泌期LPAR3在子宮內膜間質細胞和上皮細胞的表達驟然下降，主要表達在子宮內膜腔上皮的細胞漿中，但是表達降低呈弱陽性反應。在晚分泌期LPAR3主要在子宮內膜間質細胞中和血管上表達，呈強陽性反應。在

11、子宮內膜的腔上皮和腺上皮上呈弱陽性表達。
　　 4.在早中增生期主要分泌雌激素(estrogen，E)，LPAR3處于低表達狀態(tài);在晚增生期成熟卵泡的顆粒細胞在黃體生成素(luteinizinghormone，LH)排卵高峰的作用下，開始分泌孕酮(progestin，P)，排卵后P逐漸增加，E分泌下降，子宮內膜上LPAR3的表達開始在早分泌期增加。在中分泌期E水平又增加，LPAR3在子宮內膜上的表達下降。在晚分泌期E水平下降，L

12、PAR3在子宮內膜上的表達開始上升。
　　 結論:
　　 1.LPAR3在人類月經周期中子宮內膜上呈周期性的變化，在人類的圍著床期LPAR3的表達達到頂峰，這種變化規(guī)律揭示LPAR3可能參與了子宮內膜容受性的建立，可作為預測子宮內膜容受性的分子參考指標。
　　 2我們把月經周期中E、LH和P的表達規(guī)律和LPAR3在子宮內膜上的表達方式相比較，我們推測LPAR3可能受到LH和P的正向調控，而E可能對這種正向調控有抑

13、制作用（見下圖）。
　　 第二部分 GnRHa長方案促排卵對圍著床期人類子宮內膜上LPAR3表達的影響
　　 目的:研究GnRHa/rFSH/hCG控制性超促排卵(COH)對圍著床期人類子宮內膜溶血磷脂酸受體3（LPAR3）表達的影響。
　　 方法:將研究對象分為自然周期對照組(NC組)和COH實驗組，用RT-RCR和Western blot方法觀察兩組排卵后3d～6d子宮內膜上LPAR3mRNA和蛋白的表達變化

14、。
　　 結果:
　　 1.NC組子宮內膜中LPAR3的表達在排卵后d4達到頂峰，COH組子宮內膜LPAR3的表達高峰較NC組要提前1d，即在排卵后d3達到頂峰。
　　 2.COH組子宮內膜LPAR3在各時間點的表達水平均低于對照組，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　 3.COH組血清中E2和P濃度水平在相應各時間點均高于NC對照組，E2/P比值也高于NC對照組，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　

15、　 結論:
　　 1.GnRHa控制性超促排卵可能通過改變子宮內膜LPAR3表達的水平和時序變化，一方面降低了子宮內膜的容受性，同時一方面也使子宮內膜與胚胎發(fā)育不同步從而降低胚胎的著床率。這提示我們可能通過改善目前移植胚胎的時間，達到子宮內膜和胚胎發(fā)育同步，從而提高IVF妊娠率。
　　 2.可能由于在GnRHa控制性超促排卵中超生理劑量的E2和P水平，以及不協(xié)調的E2/P比造成了LPAR3表達的異常。我們可能通過調節(jié)E

16、2/P比值，使LPAR3的表達恢復正常狀態(tài)，提高IVF妊娠率。
　　 第三部分 LPAR3在PCOS患者月經周期子宮內膜上的表達
　　 目的:研究溶血磷脂酸受體3(Lysophosphatidic acid receptor3，LPAR3)mRNA及其蛋白在PCOS月經稀發(fā)患者月經周期中子宮內膜上的表達。
　　 方法:采用RT-PCR，Western blot方法，檢測LPAR3 mRNA和蛋白在PCOS月經稀發(fā)

17、患者月經周期中子宮內膜上的表達。
　　 結果:
　　 1.PCOS組患者月經周期天數(shù)為39.75天，明顯多于NC對照組月經周期天數(shù)30.5天(P＜0.01)。在增殖期PCOS組血清中LH水平為8.61miu/ml，高于NC組增殖期血清中LH水平3.10miu/ml，有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。在早、中分泌期PCOS組患者血清中P水平1.64ng/ml、6.36ng/ml，明顯低于NC組P水平4.46ng/ml、14.2

18、ng/ml，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　 2.PCOS組在整個增生期LPAR3 mRNA和蛋白在子宮內膜上呈低表達狀態(tài)，但與NC對照組增生期相比要高于NC對照組，有統(tǒng)計學差異。在早分泌期LPA3 mRNA和蛋白表達明顯升高，并且達到峰值，在中分泌期LPAR3 mRNA和蛋白的表達驟然下降，恢復到增生期水平。PCOS組中LPAR3mRNA和蛋白水平在早分泌期子宮內膜上的表達要明顯低于NC對照組，有統(tǒng)計學差異（見下圖）。

19、r>　　 結論:
　　 1.PCOS組中增生期LPAR3的異常表達可能和PCOS患者子宮內膜過度增殖相關。
　　 2.PCOS組中在早分泌期即圍著床期LPAR3的表達較NC對照組低，這可能干擾了其子宮內膜容受性的建立，降低了子宮內膜的容受性。
　　 3.PCOS組在增生期血清中LH水平的高表達以及在分泌期P的低表達狀態(tài)可能和其子宮內膜上LPAR3異常表達相關。
　　 第四部分兩種雌孕激素替代法內膜準備對

20、多囊卵巢綜合癥冷凍胚胎移植臨床效果的比較
　　 目的:比較非降調節(jié)雌孕激素替代法與降調節(jié)雌孕激素替代法作為子宮內膜準備方法對多囊卵巢綜合癥患者(PCOS)凍融胚胎移植(FET)的妊娠結局。
　　 方法:在PCOS患者FET周期中，分別采用非降調節(jié)雌孕激素替代法（GnRHa組，n=89）、降調節(jié)雌孕激素替代法（HRT組，n=37）準備內膜，比較周期妊娠率、種植率、流產率、宮外孕發(fā)生率等指標。
　　 結果:
　

21、　 1.HRT組和GnRHa組2組患者年齡分別為29.53±3.39歲、29.24±2.85歲(P＞0.05);基礎體重指數(shù)分別為23.07±3.51、22.20±2.96(P＞0.05);不孕年限分別為3.14±1.89年、3.86±1.36年(P＞0.05);
　　 2.在黃體支持日HRT組和GnRHa組2組患者E水平分別為189.72±110.88pg/ml、133.08±55.33pg/ml(P＜0.05); LH水平

22、分別為11.74±6.49miu/ml、1.3±0.67miu/ml(P＜0.01)。
　　 3.2組移植周期臨床妊娠率為55.06％、72.9％(P＜0.05);種植率分別為38.7％、53.6％(P＜0.05);流產率分別為16.3％、14.8％(P＞0.05);宮外孕率分別為4.1％、3.7％(P＞0.05)。
　　 結論:對于PCOS患者使用降調節(jié)雌孕激素替代法可能改善子宮內膜的容受性，是一種合適的子宮內膜準備方