人類白細(xì)胞抗原G5對胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力及子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞容受性的調(diào)控.pdf

1、研究背景:
　　HLA-G屬于非經(jīng)典HLAIb類蛋白,限制性表達(dá)于胚胎絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞,在妊娠過程中調(diào)控母胎免疫耐受。HLA-G5為結(jié)構(gòu)最為完整的可溶性HLA-G蛋白,在胚胎著床中作用尤為重要。HLA-G在妊娠過程中的調(diào)控作用主要包括:1.增加子宮內(nèi)膜容受性;2.調(diào)控胚胎生長、分化和發(fā)育;3.維持妊娠過程中子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞對胚胎的免疫耐受。但是目前已知的HLA-G功能多局限于免疫學(xué)功能,HLA-G是否存在非免疫學(xué)功能尚不清楚。本

2、研究主要關(guān)注可溶性HLA-G5蛋白對胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞的非免疫學(xué)作用。
　　研究目的:
　　1.構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)并純化可溶性HLA-G5重組蛋白;
　　2.研究HLA-G5重組蛋白對胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的影響及機(jī)制;
　　3.研究HLA-G5重組蛋白對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞容受性的影響及機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.應(yīng)用PCR、Westernblot和免疫熒光方法檢測胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(JA

3、r、JEG-3和原代滋養(yǎng)層細(xì)胞)和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(Ishiakwa)中HLA-G5及其受體KIR2DL4和LILRB1表達(dá);
　　2.應(yīng)用過PCR方法從HLA-G陽性細(xì)胞系JEG-3中擴(kuò)增HLA-G5cDNA,將之轉(zhuǎn)化入E.coliBL21系統(tǒng),在30°C、IPTG誘導(dǎo)下建立HLA-G5原核細(xì)胞蛋白表達(dá)體系,利用蛋白重構(gòu)試劑盒將HLA-G5重組蛋白純化并重構(gòu);
　　3.應(yīng)用微量蛋白熒光標(biāo)記試劑盒標(biāo)記HLA-G5重組蛋白,通

4、過流式細(xì)胞術(shù)檢測HLA-G5與細(xì)胞的結(jié)合能力;
　　4.使用細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測HLA-G5重組蛋白對胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖能力的影響;
　　5.使用細(xì)胞遷移能力試劑盒檢測HLA-G5重組蛋白對胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞遷移能力的影響;
　　6.使用Transwell小室檢測HLA-G5重組蛋白對JAr和JEG-3細(xì)胞侵襲能力的影響;
　　7.應(yīng)用ELISA和CytokineArray方法檢測HLA

5、-G5重組蛋白對胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子(IL-2、IL-10、IL-6、TNF-α、IFN-γ)的影響;
　　8.應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測HLA-G5重組蛋白對JAr和JEG-3細(xì)胞中蛋白酶uPA和MMPs表達(dá)水平的影響;使用uPA活性檢測試劑盒測定HLA-G5重組蛋白對JAr和JEG-3細(xì)胞分泌的蛋白酶uPA活性的影響;采用明膠酶譜法檢測HLA-G5重組蛋白處理后JAr和JEG-3細(xì)胞分泌蛋白酶MMP

6、2和MMP9活性的變化;
　　9.應(yīng)用Westernblot方法檢測影響胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的信號傳導(dǎo)通路,在侵襲實(shí)驗(yàn)中使用信號通路抑制劑驗(yàn)證;
　　10.采用胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞球(JAr)與單層子宮內(nèi)膜細(xì)胞(Ishikawa)共培養(yǎng)體外模型模擬胚胎著床,檢測HLA-G5重組蛋白對胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞球(JAr)與單層子宮內(nèi)膜細(xì)胞(Ishikawa)粘附率的影響;
　　11.檢測HLA-G5重組蛋白對Ishikawa細(xì)胞中粘附

7、蛋白E-cadherin和β-catenin的影響;
　　12.所有實(shí)驗(yàn)中對照組為未經(jīng)HLA-G5處理組,通過SigmaPlot11.0軟件應(yīng)用t檢驗(yàn)或單因素方差分析方法(數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布時,采用非參數(shù)檢驗(yàn))對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.在pET-15b載體中插入HLA-G5基因,并于大腸桿菌BL21中表達(dá)HLA-G5重組蛋白,基因序列和蛋白質(zhì)序列與野生型相比無突變;HLA-G5重組蛋白經(jīng)過純化和重構(gòu)

8、,具有生物學(xué)功能;
　　2.JEG-3細(xì)胞表達(dá)HLA-G5蛋白,JAr和Ishikawa細(xì)胞不表達(dá)HLA-G5蛋白;JEG-3、JAr和Ishikawa細(xì)胞均表達(dá)HLA-G5受體KIR2DL4和LILRB1;3.HLA-G5重組蛋白能夠與JAr、JEG-3和Ishikawa細(xì)胞特異性結(jié)合;
　　4.1μg/mLHLA-G5重組蛋白不影響胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(JAr和JEG-3)和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(Ishikawa)增殖能力和遷移能

9、力;
　　5.1μg/mLHLA-G5重組蛋白能夠使JAr和JEG-3細(xì)胞侵襲能力分別增強(qiáng)至(189.52±19.74)％和(148.39±38.18)%;
　　6.1μg/mLHLA-G5增加JAr和JEG-3細(xì)胞中蛋白酶uPA和MMPs的表達(dá)和活性;
　　7.1μg/mLHLA-G5重組蛋白不影響JAr和JEG-3細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6水平;1μg/mLHLA-G5重組蛋白處理24小時后,子宮內(nèi)膜細(xì)胞(Ishikaw

10、a)培養(yǎng)液中IL-6分泌水平降低;
　　8.1μg/mLHLA-G5重組蛋白處理JAr和JEG-3細(xì)胞5分鐘至30分鐘后,細(xì)胞中MAPK信號傳導(dǎo)通路中的ERK和SAPK/JUN磷酸化水平增加;ERK和SAPK/JUN抑制劑能夠抑制JAr和JEG-3細(xì)胞侵襲能力;
　　9.HLA-G5重組蛋白使胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞球(JAr)和子宮內(nèi)膜單層細(xì)胞(Ishikawa)的粘附率增加;
　　10.HLA-G5重組蛋白處理Ishikaw

11、a細(xì)胞30分鐘后,細(xì)胞粘附因子E-cadherin和β-catenin表達(dá)水平下降。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建HLA-G5蛋白原核表達(dá)系統(tǒng),能夠得到大量、高純度HLA-G5重組蛋白;
　　2.HLA-G5重組蛋白可以增強(qiáng)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力,這一作用通過胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞上HLA-G5受體KIR2DL4和LILRB1介導(dǎo),通過增強(qiáng)細(xì)胞蛋白酶MMPs和uPA的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白酶活性實(shí)現(xiàn),其中涉及MAPKs細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通