Chi-miR-182對NTS和TES基因及子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞調(diào)控作用的研究.pdf

本研究以奶山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(EEC)為研究對象，構(gòu)建雙熒光素酶報告載體驗(yàn)證miR-182與NTS和TES的靶向關(guān)系，用Real-time PCR、Western Blot等方法研究miR-182對基因NTS、TES和Caspase-8、p38表達(dá)量的影響。構(gòu)建pcDNA3.1(+)過表達(dá)載體，研究NTS和TES的相互作用、對Caspase-8和p38蛋白表達(dá)量以及對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　1.驗(yàn)證miR-182與NTS和TES的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系
　　生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)奶山羊NTS基因3'UTR存在miR-182靶位點(diǎn)，TES基因CDS區(qū)存在miR-182靶位點(diǎn)。構(gòu)建雙熒光素酶報告載體，分別與miR-182模擬物、Negative control(NC)共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。結(jié)果表明，與對照組NC相比，miR-182模擬物顯著抑制了熒光素酶活性，表明miR-182通過與NTS-3'UTR相互作用導(dǎo)致熒光素酶活性降低(P＜0.05)，與TES基因CDS區(qū)相互作用導(dǎo)致熒光素酶活性降低(P＜0.05)。據(jù)此，本研究初步鑒定NTS和TES為miR-182的靶基因。
　　2.驗(yàn)證miR-182對NTS、TES、Caspase-8、p38表達(dá)量的影響
　　采用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測NTS和TES基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與對照組相比，miR-182在mRNA和蛋白水平均顯著抑制靶基因NTS和TES的表達(dá)(P＜0.05)。采用Westem Blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-182顯著增加了Caspase-8的蛋白表達(dá)量(P＜0.05)，減少了p38的蛋白表達(dá)量(P＜0.05)。
　　3.檢測NTS和TES對Caspase-8、p38表達(dá)量的影響
　　構(gòu)建pcDNA3.1(+)-NTS和pcDNA3.1(+)-TES過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染EEC，采用Western Blot技術(shù)檢測Caspase-8和p38表達(dá)量，并與對照組相比。結(jié)果顯示過表達(dá)NTS和TES顯著降低了Caspase-8蛋白表達(dá)量(P＜0.05)，增加了p38的蛋白表達(dá)量(P＜0.05)。這一結(jié)果與miR-182對Caspase-8、p38表達(dá)量的影響結(jié)果相反。
　　4.驗(yàn)證NTS和TES的相互作用和對EEC凋亡的影響
　　將pcDNA3.1(+)-NTS和pcDNA3.1(+)-TES過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染EEC，通過Real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測NTS和TES基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NTS顯著抑制了TES mRNA和蛋白水平表達(dá)量(P＜0.05)。而過表達(dá)TES基因只減少了NTS蛋白的表達(dá)量(P＜0.05)，對NTS mRNA沒有顯著影響(P＞0.05)。用流式細(xì)胞儀檢測pcDNA3.1(+)-NTS和pcDNA3.1(+)-TES對EEC凋亡的影響，結(jié)果表明NTS和TES均顯著抑制了EEC凋亡(P＜0.05)。
　　以上結(jié)果表明，NTS和TES為miR-182的靶基因，miR-182可能通過下調(diào)NTS和TES，上調(diào)Caspase-8而影響奶山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡。